إنشاء خطوط الخلايا Overexpressing DR3 لتقييم الاستجابة Apoptotic للعلاجات المضادة الانقسامية
Summary
يمكن أن يتم إنشاء خط خلية مستقرة overexpressing مورثة اهتمام لدراسة وظيفة الجينات باستنساخ واحدة تعداء-الانتقاء مستقرة بعد ترانسفيكتينج لهم عن طريق العدوى للفيروس. هنا نظهر أن خطوط الخلايا HT29-DR3 التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة توضيح الآليات بالموت التي تسهم مستقبلات 3 (DR3) المبرمج المستحثة أنتيميتوتيكس.
Abstract
ويمكن تحقيق دراسة وظيفة الجينات التي تهم عن طريق التلاعب في مستواه في التعبير، مثل تخفيض في التعبير مع خطوط الخلايا ضربة قاضية أو زيادة في التعبير مع خطوط الخلايا أوفيريكسبريشن. تعداء العابرة والمستقرة هي اثنين من الأساليب التي غالباً ما تستخدم للتعبير الجيني خارجية. تعداء عابر يفيد فقط للتعبير قصيرة الأجل، بينما يسمح تعداء مستقرة الجينات الخارجية أن تدمج في جينوم الخلية المضيفة حيث سوف تكون بشكل مستمر وأعرب عن. نتيجة لذلك تعداء مستقرة عادة ما يعمل للبحث في التنظيم الجيني طويلة الأجل. هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لإنشاء خط خلية مستقرة overexpressing مستقبلات الموت المعلمة 3 (DR3) لاستكشاف الدالة DR3. اخترنا استنساخ واحدة بعد إصابة الفيروس من أجل الحفاظ على التجانس والنقاء من خطوط الخلايا مستقرة. خطوط الخلية المستقرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول تقديم تفتقر إلى DR3 HT29 الخلايا الحساسة للمخدرات أنتيميتوتيك، وبالتالي إعادة تشكيل الاستجابة أبوبتوتيك في الخلايا HT29. وعلاوة على ذلك، العلامة العلم على DR3 يعوض عن عدم توافر حسن DR3 جسم وتيسر الدراسة البيوكيميائية الآلية الجزيئية التي تحفز وكلاء antimitotic المبرمج.
Introduction
غالباً ما يستخدم التعبير الجيني مغايرة لدراسة وظيفة الجينات للفائدة. طريقتين، تعداء العابرة والمستقرة، وتستخدم سائد في الخلايا، والبيولوجيا الجزيئية لإدراج شريحة من الحمض النووي الريبي أو في خلية مضيف1،2. Transfected عابر الحمض النووي الريبي أو لا يمكن أن تنتقل إلى الخلايا الوليدة، حتى التعديل الوراثي يمكن فقط الاحتفاظ بها لفترة قصيرة من الزمن. من ناحية أخرى، في خلايا transfected ثابت، تتكامل الجينات الخارجية جينوم الخلية المضيفة، إدامة تعبيراً عنه في خط الخلية. وهكذا، تعداء مستقرة هو طريقة التي عادة ما تكون محجوزة للبحث في التنظيم الجيني طويلة الأجل. يمكن أيضا يمكن زرعها خط الخلية مستقرة تكثيفها في نماذج الماوس في فيفو دراسة3. تعداء مستقرة يمكن تقسيمها إلى فئتين: الفيروسية وفاجيناليس. بالمقارنة مع تعداء فاجيناليس، يمكن نقل العدوى الفيروسية الجينات إلى مجموعة أوسع نطاقا من الخلايا البشرية بأعلى كفاءة4،5،،من67. وعلاوة على ذلك، يوفر خط خلية مستقر من نسخة واحدة بميزة التجانس والنقاء الاستنساخ.
نمو الخلايا غير المنضبط والشعبة هي السمات المميزة أكثر من السرطان. في إعدادات السريرية، هي عوامل antimitotic العلاجات الأساسية لأنواع عديدة من الأورام8. ومع ذلك، لا يمكن تجاهل بعض القيود الهامة من وكلاء أنتيميتوتيك. أولاً، هذه تشيموثيرابيس أيضا يمكن أن تقتل الخلايا الطبيعية إلى جانب الخلايا السرطانية غير مرغوب فيها، وهكذا، يمكن أن ينتج آثار جانبية حادة8. ثانيا، لتيوبيولين المخدرات ليست فعالة ضد جميع أنواع الأورام، على الرغم من التعبير توبولين في كل مكان في مجموعة متنوعة واسعة من الأنسجة المختلفة بروتين سيتوسكيليتال9،10. من غير الواضح لماذا وكلاء لتيوبيولين أظهرت فعالية واعدة ضد المبيض، الرئة، وسرطان الدم في العلاج السريري، ولكن ليس في الكلي أو القولون أو سرطان البنكرياس11. أخيرا، حتى المرضى الذين يعانون من نفس النوع من الورم يمكن الاستجابة أنتيميتوتيكس بشكل مختلف بطريقة لا يمكن التنبؤ بها. قد يكون هناك جزيء المستجيب رئيسية التي تؤثر على حساسية مختلف المرضى إلى وكلاء أنتيميتوتيك، أسفر عن نتائج متنوعة في العلاج السريري12. وهكذا، الحساسيات التفاضلية المحتملة من المرضى على العلاج أنتيميتوتيك ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار من أجل تحسين التدخلات العلاجية13.
شاشة مكتبة siRNA الجامع-الجينوم الفائق أثبتت أن DR3 ضربة قاضية يمكن أن يجعل حساسية خلايا مقاومة للعقاقير أنتيميتوتيك، تورط بدور ل DR3 في14من المبرمج الناجمة عن العلاج الكيميائي. كعضو من فوق عائلة مستقبلات (تنفر) عامل نخر الورم، أبلغ DR3 للتوسط في الخلية المبرمج في مختلف نظم15،،،من1617،18. وهكذا، شرعنا في إنشاء خطوط الخلايا مستقرة overexpressing DR3 دراسة الآليات الجزيئية التي تحفز المخدرات antimitotic المبرمج. يمكن أن توفرها نموذج خلية مناسبة لدراسة DR3 overexpression خط خلية سرطان القولون البشرية HT29، الذي وجد أن تفتقر إلى DR3. بالإضافة إلى ذلك، في العيادة، سرطان القولون حساس للأدوية أنتيميتوتيك19.
في هذه المقالة، نحن تصف أسلوب الذي يتيح توليد خط HT29-DR3 خلية مستقرة من خلال الإصابة بالفيروس. كذلك نعرض كيفية التحقق من صحة التعبير DR3 في هذه الخلايا باستخدام النشاف الغربية وكيفية تقييم الحساسية لوكلاء أنتيميتوتيك باستخدام الخلية جدوى الفحص والمراقبة المورفولوجية. الخلايا تتضخم من استنساخ واحدة، وهكذا، تتميز بخلفية الوراثية متجانسة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح العلامة العلم في DR3 لتصور DR3 الخلوية بالفحص المجهري، وتحليل التفاعل البروتين والتعبير الجيني بالنهج البيوكيميائية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون الخلايا إكسينوجرافتيد في الفئران لمواصلة تحليل تطور الورم ردا على أنتيميتوتيكس في فيفو14.
النظام الخليوي HT29-DR3 المعروضة هنا يوفر أداة فعالة لدراسة الآليات الجزيئية لكيفية أنتيميتوتيكس تقتل خلايا السرطان14. منذ أوفيريكسبريسيون وخطوط الخلية ضربة قاضية أدوات مشتركة لدراسة وظيفة الجينات، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لجينات أخرى من الفائدة أو خطوط الخلايا الأخرى و، وهكذا تحولت إلى نهج المستخدمة على نطاق واسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، يصف لنا طريقة لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة HT29-DR3. الخلايا HT29-DR3 توفر نموذجا لدراسة الآليات الجزيئية التي يساهم DR3 المبرمج الناجمة عن عوامل أنتيميتوتيك. وهذا النهج مرنة وقابلة للتكرار. لضمان نجاح هذا الإجراء، يلزم أربع خطوات رئيسية للبروتوكول بالنظر فيها. أولاً، من أجل إنتاج ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منح 53110000117 (إلى غيغاواط) و 043222019 (إلى X.W.) من جامعة تشينغهوا.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
