El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.
Tejido adiposo es un órgano metabólico importante con alta plasticidad y responde a estímulos ambientales y estado nutricional. Como tal, han desarrollado varias técnicas para estudiar la morfología y la biología del tejido adiposo. Sin embargo, métodos de visualización convencionales se limitan a estudiar el tejido en secciones 2D, pudiendo capturar la arquitectura 3D del órgano entero. Aquí presentamos el conjunto de montaje coloración, un método de inmunohistoquímica que conserva intacto el tejido adiposo morfología con pasos de proceso mínima. Por lo tanto, se mantienen las estructuras de los adipocitos y otros componentes celulares sin distorsión, lograr la visualización 3D más representativa del tejido. Además, Monte toda la coloración se puede combinar con métodos de rastreo de linaje para determinar las decisiones de destino celular. Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones para proporcionar información precisa con respecto a partes más profundas del tejido adiposo. Para superar esta limitación, todo Monte tinción más combinables con técnicas para eliminar la opacidad del tejido y permitir la visualización completa de la anatomía de todo el tejido adiposo mediante microscopía fluorescente luz-hoja de limpieza del tejido. Por lo tanto, una mayor resolución y una representación más precisa de las estructuras de tejido adiposo pueden ser capturados con la combinación de estas técnicas.
Tejido adiposo es un órgano esencial para el almacenamiento de energía y se caracteriza por remodelación dinámica y expansión casi ilimitada1. Además de homeostasis de energía, el tejido adiposo también juega un papel esencial en la secreción de la hormona de más de 50 adipokines para modular la función metabólica de todo el cuerpo2. El tejido adiposo tiene una arquitectura diversa que consta de diversos tipos celulares como adipocitos maduros, fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y adipocito progenitoras células3. Estudios recientes han demostrado que la obesidad y otra disfunción metabólica pueden alterar significativamente la función del tejido adiposo y su microambiente, que incluye pero no se limita a la ampliación de los adipocitos, infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, los macrófagos) y disfunción vascular3.
Técnicas morfológicas convencionales como la histología y cryosectioning demuestran varias limitaciones en el estudio de Biología adiposo como pasos largos procesos químicos, que puede conducir a tejido estructura y contracción distorsión3, 4. Además, estas técnicas 2D son insuficientes para observar las interacciones intercelulares ejercidas por diversos tipos celulares, como las secciones obtenidas se limitan a regiones más pequeñas del tejido entero3. Métodos en comparación con convencional de imágenes fluorescentes, todo montaje coloración no requiere de otras medidas invasivas, como inclusión, seccionamiento y deshidratación; por lo tanto, esto evita el problema de disminuir la especificidad del anticuerpo. Como tal, es un método sencillo y eficaz para la proyección de imagen el tejido adiposo, con mejor preservación de la morfología de los adipocitos y de estructura de tejido adiposo total5. Por lo tanto, todo montaje de tinción como una técnica rápida y barata de la inmunomarcación fue establecida para preservar tejido adiposo arquitectura 3D1,6,7,8.
Sin embargo, a pesar de la preservación de la morfología del tejido adiposo con el uso de tinción montaje en conjunto, esta técnica es todavía incapaz de visualizar estructuras internas, debajo de la superficie lipídica de los tejidos. Varios recientes estudios9,10 han creado tejido claro técnicas combinadas con inmunomarcación conjunto montaje1,6 para permitir la visualización completa en 3D dentro del tejido adiposo. En particular, redes neuronales y vasculatura densas fueron visualizadas en reciente estudios9,10,11,12 con la proyección de imagen de volumen 3D. De hecho, estudiando la plasticidad neural y vascular del tejido adiposo en diferentes condiciones fisiológicas es esencial para el estudio de su biología. Proyección de imagen tridimensional de inmunomarcación compatible de claro de tejido de órganos despejó de solvente (iDISCO +) es un proceso compuesto por tratamiento previo de metanol, inmunomarcación y claro de opacidad tejido con reactivos químicos orgánicos diclorometano (DCM ) y dibencilo éter (DBE)13,14. Haciendo que el tejido adiposo totalmente transparente, puede obtenerse una representación más precisa de la anatomía dentro de los tejidos como vasos sanguíneos y fibras nerviosas9,10. IDISCO + tiene ventajas en que es compatible con varios anticuerpos y Reporteros fluorescentes11,14, y se ha demostrado éxito en múltiples órganos y embryoes hasta14. Sin embargo, su principal limitación es un tiempo de incubación, en el que 18 a 20 días se necesitan para completar todo el experimento.
Otra aplicación importante de montaje conjunto de tinción es la visualización del destino celular en combinación con un sistema de rastreo de linaje. Seguimiento del linaje es el etiquetado de un gen/marcador específico en una celda que puede transmitirse a todas las células de la hija y se conserva largo tiempo15. Como tal, es una poderosa herramienta que puede utilizarse para determinar el destino de la progenie de una célula15. Desde la década de 1990, sistema Cre-LoxP recombinante se ha convertido en un poderoso enfoque para seguimiento del linaje en la vida de los organismos15. Cuando una línea de ratón que expresa Cre, una enzima recombinase de ADN, se cruza con otra línea de ratón expresan un reportero que es adyacente a una secuencia loxP-parada-loxP, la proteína reportera es expresado15.
Para la tinción de todo montaje, el uso de fluorescentes reporteros multicoloras es adecuado para la proyección de imagen del tejido adiposo porque permite la interferencia mínima con actividades intracelulares del adipocito16. Sin embargo, reporteros tradicionales típicamente manchan el citoplasma, lo que es difícil rastrear el linaje de los adipocitos blancos, que tienen un limitado contenido citoplásmico17. Para superar este problema, el uso del marcador de membrana membrana tdTomato fluorescente eGFP (mT/mG) reporter es una herramienta ideal. Orientada a la membrana tdTomato se expresa en Cre-negativo células18. Sobre supresión de Cre, un interruptor para la expresión de eGFP orientada a la membrana se produce, lo que este reportero adecuado para rastrear el linaje del adipocito progenitores17,18 (Complementario de la figura 1).
El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para montaje en conjunto tinción y mostrar cómo se puede combinar con otras técnicas para estudiar el desarrollo y la fisiología del tejido adiposo. Dos ejemplos de aplicaciones descritas en este protocolo son su uso con líneas de ratón reportero 1) multicolor para identificar los distintos orígenes de los adipocitos y 2) tejido claro para visualizar más la arborización neuronal en el tejido adiposo blanco (WAT).
Aunque las técnicas convencionales como la histología y criosección ofrecen beneficios para la observación de la estructura intracelular, conjunto Monte coloración proporciona una perspectiva diferente en la investigación de tejido adiposo, que permite la visualización en 3D de celular arquitectura del tejido mínimamente procesada.
Con el fin de realizar con éxito el montaje conjunto de tinción, las siguientes sugerencias deben tomarse en consideración. Depósitos de tejido adiposo …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por subvenciones de las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) de Canadá, piloto y beca de estudio de viabilidad de Banting y Best Diabetes centro (BBDC), el fondo inicial de SickKids a H-K. S., médica centro de programa de investigación (2015R1A5A2009124) a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y futuro planea J r
LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
Paraformaldehyde (PFA) | |||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
Triton-X | |||
Tween | |||
Animal serum (goat, donkey) |