현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.
지방이 많은 직물은 높은 소성으로 중요 한 변화 기관 이다 이며 환경 자극 및 영양 상태에 반응. 따라서, 다양 한 기법 형태학 및 지방이 많은 직물의 생물학 연구 개발 되었습니다. 그러나, 기존의 시각화 방법을 공부 전체 기관의 3D 아키텍처를 캡처를 2D의 섹션에서 조직으로 제한 됩니다. 여기에 우리가 전체-마운트 현재 얼룩, 최소한의 처리 단계를 그대로 지방 조직 형태를 유지 하는 immunohistochemistry 메서드. 따라서, adipocytes 및 다른 세포 구성 성분의 구조는 조직의 가장 대표적인 3D 시각화를 달성 하는 왜곡 없이 유지 됩니다. 또한, 전체 마운트 얼룩 세포 운명 결정을 결정 하는 계보 추적 방법 결합할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지방이 많은 직물의 더 깊은 부분에 관한 정확한 정보를 제공 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 한계를 극복 하기 위해 전체 산 얼룩이 지 수 추가와 결합 될 조직 기법 조직의 불투명 함 제거 하 고 빛-시트 형광 현미경을 사용 하 여 전체 지방 조직 해부학의 완전 한 시각화에 대 한 허용을 삭제. 따라서, 더 높은 해상도 지방 조직 구조의 더 정확한 표현을 이러한 기술의 조합으로 캡처할 수 있습니다.
지방 조직 에너지 저장에 대 한 필수적인 장기 이며 동적 개장 및 거의 무제한 확장1특징 이다. 에너지 항상성, 지방 조직 또한 담당 한다 필수적인 역할 50 adipokines2전체 신체 신진 대사 기능 조절 하는 호르몬 분 비에. 지방 조직 성숙 adipocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 면역 세포, 및 체형 조상 세포3를 포함 하 여 다양 한 세포 유형의 다양 한 아키텍처 구성 하고있다. 최근 연구는 비만 다른 대사 장애 크게 변경할 수 지방 조직 기능 및 그것의 microenvironment, 포함 하지만 adipocytes, 염증 세포의 침투의 확대에 국한 되지 않습니다 (예: 대 식 세포), 및 관 역 기능3.
조직학, cryosectioning 등 기존의 형태학 기법 설명 조직 수축 및 구조 왜곡3로 이어질 수 있는 긴 화학 처리 단계와 같은 많은 생물학을 공부 하 고 몇 가지 제한 4. 또한, 이러한 2D 기술을 얻은 섹션은 전체 조직을3의 작은 지역에 한정 된 다른 세포 유형에 의해 발휘 된 세포 상호 작용을 관찰 충분 하지 않습니다. 기존에 비해 형광 이미징 방법, 전체 마운트 얼룩 단계가 필요 없습니다 추가 침략, 등 포함, 단면, 탈수; 따라서,이 항 체 특이성을 감소의 문제를 방지 합니다. 이와 같이, 체형 형태 및 전반적인 지방 조직 구조5의 더 나은 보존 이미징 지방 조직에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법입니다. 따라서, 전체 마운트 얼룩으로 신속 하 고 저렴 한 immunolabeling 기법 지방 조직 3D 아키텍처1,6,,78을 유지 하기 위해 설립 되었다.
그러나, 전체 마운트 얼룩의 사용과 지방이 많은 직물 형태학의 보존에도 불구 하 고이 기술은 조직의 지질 표면 아래 내부 구조 시각화 수 아니다. 몇몇 최근 연구9,10 조직 지방 조직 내에서 포괄적인 3D 시각화 수 있도록 전체 마운트 immunolabeling1,6 와 결합 하는 기법을 삭제를 설립 했다. 특히, 조밀한 신경 및 맥 관 구조 네트워크 최근 연구9,10,,1112 3D 볼륨 영상과 시각화 했다. 실제로, 다른 생리 적인 조건 하에서 지방 조직의 신경 및 혈관 소성을 공부 하 고 그것의 생물학을 공부 필수적 이다. 솔벤트 허가 기관 (iDISCO +) 조직 비운의 3-차원 영상 Immunolabeling 사용은 비운의 유기 화학 시 약 dichloromethane (DCM와 불투명 함 조직 그리고 메탄올 전처리, immunolabeling의 구성 과정 )와 dibenzyl 에테르 (DBE)13,14. 지방 조직을 투명 하 게 함으로써, 혈관과 신경 섬유 등 조직 내의 해부학의 더 정확한 표현9,10얻을 수 있습니다. IDISCO + 장점이 그것은 다양 한 항 체와 형광 기자11,14, 그리고 여러 장기와 심지어 embryoes14에서 성공을 보여주었다. 그러나, 그것의 주요 제한은 있는 18 ~ 20 일 전체 실험을 완료 하는 데 필요한 긴 보육 시간입니다.
전체 산 얼룩의 또 다른 중요 한 응용 프로그램 계보 추적 시스템와 함께에서 셀 운명의 시각화 이다. 계보 추적 모든 딸 세포에 전달 될 수 있다 고15시간 이상 보존 하는 셀에는 특정 유전자/마커 라벨입니다. 따라서, 셀의 자손15의 운명을 결정 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 1990 년대 이후, Cre LoxP 재조합 시스템 생활의 혈통 추적에 대 한 강력한 접근 되고있다 유기 체15. Cre, DNA recombinase 효소를 표현 하는 마우스 선을 loxP-정지-loxP 시퀀스에 인접 한 기자를 표현 하는 다른 마우스 라인 넘은, 기자 단백질 표현된15입니다.
전체-마운트 얼룩에 대 한 형광 색 기자 들의 사용은 세포내 활동 체형16의 최소한의 간섭에 대 한 허용 하기 때문에 지방이 많은 직물의 이미징 적합 합니다. 그러나, 전통적인 기자는 일반적으로 제한 된 세포질 콘텐츠17흰색 adipocytes의 계보를 추적 하 고 어려운 세포질, 얼룩. 이 문제를 해결 하려면 막 도약 형광 tdTomato/막 eGFP (mT/mG) 기자 마커를 사용 하 여 이상적인 도구입니다. 막-타겟 tdTomato Cre 음수가 셀18로 표시 됩니다. Cre 절단 시 막 대상 eGFP 식 스위치,이 기자 체형 창시자17,18 (보충 그림 1)의 계보를 추적에 대 한 적당 한 만드는 발생 합니다.
이 문서의 목적은 전체 마운트 얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 결합 하 수 다른 기술을 개발 및 지방이 많은 직물의 생리학을 공부 하는 방법을 보여 것입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 응용 프로그램의 두 가지 예는 1) 멀티 컬러 기자 마우스 라인 adipocytes 2) 조직 흰색 adipose 조직 (WAT)에 신경 arborization 추가 시각화를 비운의 다양 한 출처를 식별 하는 사용.
조직학 및 cryosection 같은 기존의 기술을 세포내 구조를 관찰에 대 한 혜택을 제공, 지방 조직 연구, 세포의 3 차원 시각화를 가능 하 게 다른 관점을 제공 합니다 전체 마운트 얼룩 최소한 처리 조직의 아키텍처입니다.
성공적으로 전체 마운트 얼룩을 수행 하기 위해 다음 제안 사항은 고려 사항으로 취해야 한다. 다른 지방 조직 창 고 수 결과가 다양 한 immunostaining; 따라서, 지?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 캐나다, 조종사 및 타당성 연구 그랜트 밴팅 최고의 당뇨병 센터 (BBDC), H.에 SickKids 시작 기금에서 교부 금에 의해 투자 되었다 미, 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 과학의 부, 정보 통신와 J R.K. 미래 계획
LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
Paraformaldehyde (PFA) | |||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
Triton-X | |||
Tween | |||
Animal serum (goat, donkey) |