Здесь мы описываем метод, чтобы оценить выражение легких адаптивной, прогнозируются регулировать воспалительные гены с помощью мыши воздействию озона или отфильтрованным воздухом на разных стадиях эстрального цикла.
МикроРНК (miRNA) профилирование стал интерес для исследователей, работающих в различных областях исследований в биологии и медицины. Текущие исследования показывают, многообещающего будущего использования адаптивной диагностики и ухода за легочных заболеваний. Здесь мы определить протокол для Мирна, профилирование для измерения относительного изобилия группы интерферирующим предсказал регулировать воспалительные гены в легочной ткани от модели мыши воспаление озона индуцированной дыхательных путей. Потому что было показано, что циркулирующие уровни полового гормона может повлиять на регулирование легких врожденного иммунитета у самок, этот метод предназначен для описания воспалительных Мирна, профилирование протокол в самок мышей, принимая во внимание эстральный цикл стадии каждого животного во время воздействия озона. Мы также рассмотреть применимые биоинформатики подходы к Мирна обнаружения и целевых методов идентификации с помощью Лимма, R/Bioconductor программного обеспечения, и программное обеспечение функционального анализа для понимания биологических контекст и пути, связанные с Дифференциальный Мирна выражение.
микроРНК (интерферирующим) являются короткие (19-25 нуклеотидов), естественным, некодирующих молекул РНК. Последовательности адаптивной эволюционных сохранение видов, предлагая важность интерферирующим в регулировании физиологические функции1. микроРНК выражение профилирование было доказано быть полезны для выявления адаптивной, которые имеют важное значение в регуляции различных процессов, в том числе иммунного ответа, дифференцировки клеток, процессов развития и апоптоз2. Совсем недавно адаптивной были признаны за их потенциального использования в терапии и диагностики заболеваний. Для исследователей, изучение механизмов регуляции генов измерения Мирна выражение может просветить модели уровне систем регулирования процессов, особенно когда Мирна информации объединяется с мРНК профилирования и другие геном масштаба данных3. С другой стороны адаптивной также было показано, быть более стабильным, чем mRNAs в широкий спектр типов образцов и также поддаются измерению с большей чувствительностью, чем белки4. Это привело к большой интерес в развитии интерферирующим качестве биомаркеров для различных молекулярных диагностических приложений, включая легочных заболеваний.
В легких адаптивной играют важную роль в процессах развития и поддержания гомеостаза. Кроме того их аномальные выражения был связан с развития и прогрессирования различных легочных заболеваний5. Воспалительные легочных заболеваний, вызванных загрязнением воздуха продемонстрировала большую серьезность и бедных прогнозом у самок, указав, что гормоны и эстральный цикл может регулировать легких врожденный иммунитет и Мирна выражение в ответ на экологические проблемы 6. в настоящем Протоколе, мы используем воздействия озона, который является одним из основных компонентов загрязнения воздуха, чтобы побудить форму воспаления легких в самок мышей, что происходит в отсутствие адаптивного иммунитета. С помощью озона, мы вызывая развитие сократимость hyperresponsiveness, который связан с повреждения эпителиальных клеток дыхательных путей и увеличение числа нейтрофилов и воспалительных медиаторов в проксимальном airways7. В настоящее время есть не хорошо описанные протоколы охарактеризовать и проанализировать интерферирующим эстрального цикла в подвергшихся воздействию озона мышей.
Ниже мы опишем простой метод для определения этапов эстрального цикла и Мирна выражение в легочной ткани самок мышей, воздействию озона. Мы также рассмотреть эффективные биоинформатики подходы к обнаружения и целевой идентификации Мирна, с акцентом на вычислительной биологии. Мы анализируем microarray данные с помощью Лимма, R/Bioconductor программное обеспечение, которое обеспечивает интегрированное решение для анализа данных из выражения гена эксперименты8. Анализ ПЦР массива данных от Лимма имеет преимущество с точки зрения власти над t теста на основе процедур при использовании небольшое количество массивов/образцы для сравнения выражений. Чтобы понять биологические контексте Мирна выражение результатов, затем мы использовали программное обеспечение функционального анализа. Для того чтобы понять механизмы, регулирующие transcriptional изменений и прогнозирования вероятных результатов, программное обеспечение сочетает в себе Мирна выражения наборов данных и знаний из литературы9. Это преимущество по сравнению с программным обеспечением, просто искать статистических обогащения в перекрывающимися наборами адаптивной.
МикроРНК профилирование является выгодным техника для диагностики заболеваний и механистические исследований. В этой рукописи мы определили протокол для оценки выражения интерферирующим прогнозам регулировать воспалительные гены в легких самок мышей, воздействию озона в различных…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантов из низ K01HL133520 (PS) и K12HD055882 (PS). Авторы благодарят д-р Джоанна Floros за помощь с озоном воздействия экспериментов.
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
-80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |