Summary

Long microRNA profilering in de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Hier beschrijven we een methode voor de beoordeling van de Long-expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen met behulp van muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in verschillende stadia van de oestrische cyclus.

Abstract

MicroRNA (miRNA) profilering is geworden van belang aan onderzoekers werken in verschillende onderzoeksgebieden van biologie en geneeskunde. Huidige studies tonen een veelbelovende toekomst van het gebruik van miRNAs in de diagnose en behandeling van longziekten. Hier definiëren we een protocol voor miRNA profilering voor het meten van de relatieve overvloed van een groep miRNAs voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in het longweefsel uit van een ozon-geïnduceerde luchtweg ontsteking muismodel. Omdat het heeft aangetoond dat circulerende sex-hormoonniveaus kan invloed hebben op de regulering van de aangeboren immuniteit longkanker bij vrouwen, is het doel van deze methode voor het beschrijven van een inflammatoire miRNA profilering protocol in vrouwelijke muizen, rekening houdend met de oestrische cyclus fase van elk dier op het moment van blootstelling van de ozon. We pakken ook toepassing bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie methodes gebruikend het limma, een R/Bioconductor-software, en functionele analysesoftware te begrijpen van de context van de biologische en de trajecten die zijn gekoppeld aan differentiële miRNA expressie.

Introduction

microRNAs (miRNAs) zijn korte (19 tot en met 25 nucleotiden), natuurlijke, niet-coderende molecules van RNA. Sequenties van miRNAs zijn evolutionaire bewaard over soorten, hetgeen wijst op het belang van miRNAs bij het reguleren van de fysiologische functies1. microRNA expressie profilering heeft bewezen nuttig zijn voor het identificeren van miRNAs die belangrijk zijn bij de regulering van een verscheidenheid van processen, waaronder de immuunrespons, celdifferentiatie ontwikkelings processen en apoptosis2. Meer recentelijk zijn miRNAs bekroond voor hun potentiële gebruik in diagnose van de ziekte en therapeutics. Voor onderzoekers bestuderen van mechanismen van genregulering, kan meten van miRNA expressie verlichten systemen-niveau modellen van regelgevende processen, vooral wanneer de miRNA informatie wordt samengevoegd met het mRNA profilering en andere gegevens van genoom-schaal3. Aan de andere kant, miRNAs hebben ook aangetoond dat het stabieler dan mRNAs in een scala van soorten van het specimen worden en zijn ook meetbaar met grotere gevoeligheid dan eiwitten4. Dit heeft geleid tot aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van miRNAs als biomarkers voor diverse moleculaire diagnostische toepassingen, met inbegrip van longziekten.

In de Long spelen miRNAs een belangrijke rol in de ontwikkelings processen en het onderhoud van homeostase. Bovendien is hun abnormale expressie geassocieerd met de ontwikkeling en de progressie van verschillende longziekten5geweest. Inflammatoire longziekte geïnduceerd door luchtverontreiniging blijkt grotere ernst en slechtere prognose bij vrouwtjes, die aangeeft dat de hormonen en de oestrische cyclus Long aangeboren immuniteit en miRNA expressie in reactie op de uitdagingen op milieugebied kunnen regelen 6. in dit protocol, gebruiken we ozon blootstelling, dat een belangrijk onderdeel van de luchtverontreiniging is, voor het opwekken van een vorm van Long ontsteking in vrouwelijke muizen dat zich bij het ontbreken van adaptieve immuniteit voordoet. Met behulp van ozon, zijn wij de ontwikkeling van hyperresponsiveness van de luchtwegen die wordt geassocieerd met luchtweg epitheliale celbeschadiging en een toename van de neutrofielen en inflammatoire mediatoren in proximale airways7inducerende. Er zijn op dit moment niet goed beschreven protocollen te karakteriseren en miRNAs over de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen analyseren.

Hieronder beschrijven we een eenvoudige methode om oestrische cyclus stadia en miRNA expressie in longweefsel van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon te identificeren. Wij richten ook effectief bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie, met de nadruk op computationele biologie. We analyseren de microarray gegevens met behulp van limma, een R/Bioconductor-software die voorziet in een geïntegreerde oplossing voor het analyseren van de gegevens van gen expressie experimenten8. Analyse van PCR array gegevens uit limma heeft een voordeel in termen van macht over t-test gebaseerd procedures bij het gebruik van kleine aantal arrays/samples te vergelijken van expressie. Te begrijpen de biologische context van miRNA expressie resultaten, we dan de functionele analysesoftware gebruikt. Om de mechanismen tot regeling van transcriptionele veranderingen te begrijpen en te voorspellen waarschijnlijk resultaten, wordt de software combineert miRNA-expressie datasets en kennis van de literatuur9. Dit is een voordeel in vergelijking met software die kijk voor statistische verrijking in overlappende sets van miRNAs.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Penn State University. 1. beoordeling van de oestrische cyclus stadium Goed beperken een vrouwelijke C57BL/6 muis (8-9 weken oud) met behulp van de muis van de hand terughoudendheid techniek beschreven in Machholz et al.,10. Vul de steriele plastic pipet met 10 μL van ultra zuiver water. De tip van de plastic pipet…

Representative Results

De verschillende soorten cellen waargenomen in de uitstrijkjes zijn gebruikt ter identificatie van de muis oestrische cyclus stadium (Figuur 1). Deze worden geïdentificeerd door de morfologie van de cel. Tijdens proestrus zijn cellen bijna uitsluitend clusters van rond-gevormde, goedgevormde genucleëerde epitheliale cellen (figuur 1A). Wanneer de muis in de estrus fase is, zijn cellen cornified squamous epitheliaale cellen, aan…

Discussion

MicroRNA profilering is een voordelige techniek voor de diagnose van de ziekte zowel mechanistisch onderzoek. In dit manuscript, hebben we een protocol om te evalueren van de expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in de longen van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon in verschillende oestrische cyclus fasen gedefinieerd. Methoden voor de bepaling van de oestrische cyclus, zoals de visuele detectiemethode, zijn beschreven16. Echter dit vertrouwen op eenmali…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van NIH K01HL133520 (PS) en K12HD055882 (PS). Dr. Joanna Floros bedanken de auteurs voor de hulp met ozon blootstelling experimenten.

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10X and 20X objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
-80 ˚C freezer Forma 7240
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μl reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

References

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

Play Video

Cite This Article
Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

View Video