Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden
Summary
Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.
Abstract
Enzimler kinaz ve pyrophosphokinase gama fosfat veya beta-gamma pirofosfat yan yüzeyler için fosforile ürünler üretebilmek için nükleotit trifosfat öncüleri aktarın. Kullanımı γ –32– P NTP öncüleri etiketli eşzamanlı substrat kullanımı ve ürün oluşumu radyografi tarafından izleme sağlar. Selüloz tabaklarda ince tabaka Kromatografi (TLC) hızlı ayırma ve substrat ve ürün hassas miktar sağlar. Biz saf (p) ppGpp sentetaz pyrophosphokinase etkinliği tahlil için ince katmanlı Kromatografi kullanan bir yöntem mevcut. Bu yöntem daha önce etkinliği döngüsel nükleotit ve dinükleotit sentetaz ile karakterize etmek için kullanılan ve geniş bir nükleotit trifosfat bağ hidrolize veya bir terminal aktarır herhangi bir enzim aktivitesinin karakterize için uygundur başka bir molekül fosfat fosfat donörden.
Introduction
Enzimler kinaz ve pyrophosphokinase (veya diphospho-kinaz) fosfatlar substrat moleküllerine nükleotit trifosfat (NTP) öncüleri aktarmak. Yüzeyler diğer nükleotit, amino asitler veya proteinler, karbonhidratlar ve lipidler1içerebilir. Bioinformatic analizleri bazen bir enzim soydaş substrat veya yüzeylerde karakterize enzimler benzerlik dayalı tahmin edebilirsiniz, ancak deneysel doğrulama hala gereklidir. Benzer şekilde, onun substrate(s) ve hangi fosfor-devret tepki tromboksan oranı için bir enzim ilgi ve etkileri etkenler, inhibitörleri veya diğer enzim effectors deneysel olarak belirlenmelidir. Bakteriyel sitoplazma mevcut diğer ATP tüketen enzimler tarafından ATP habercisi tükenmesi önlemek için saf protein nicel etkinlik deneyleri gerektirir.
Protein Saflaştırma metal benzeşme Kromatografi tarafından iyice edebiyat2,3‘ te karşılanmıştır. N – veya C-terminus için Rekombinant protein eklenmiş altı ardışık histidin kalıntıları oluşan histidin Tag hızlı arıtma metal benzeşme Kromatografi4,5,6tarafından izin verir. Bu DNA dizileri bazen protein istikrar ve/veya enzim kinetiği7,8değiştirebilirsiniz, ancak onlar değiştirmek ve genellikle protein işlevi, en az bir etkisi proteinler karşılaştırıldığında küçüktür. Histidin Etiketler, N – ve C-termini aynı protein söz konusu protein yapısını bilmeden tahmin etmek zor farklı etkileri olabilir. Histidin Etiketler genellikle bir Rekombinant protein altı histidin kalıntıları, ya hemen kodlamak astar tasarlayarak 3′ ATG başlama kodonu veya hemen 5′-kodonu açık okuma çerçevesi, klonlama sırasında dahil edilmiştir. Amplifikasyon sonra hexahistidine içeren gen indüklenebilir bir organizatörü kontrol altında bir vektör içine bakmaksızın ve ifade, genellikle E. colibir laboratuvar suşu. Rekombinasyon protein sonra immobilize divalent katyonlar (genellikle nikel veya kobalt)9içeren bir benzeşme reçine izole. Yerel metal bağlanıcı proteinler kirletici rekabetçi ilişkili protein2yerinden imidazole ile titrasyon tarafından kaldırılabilir. Son olarak, hedef protein imidazole daha yüksek konsantrasyonları ile sütun eluted. Çeşitli ticari kaynaklar için immobilize metal katyon reçineler ve üreticileri imidazole konsantrasyonları ve tampon koşulları için öneriler sağlar. Elüsyon sonra protein Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz, diyaliz veya olabilir hemen içinde işlevsel testleri kullanılır.
Dolaylı olarak serbest bırakır veya Kemiluminesan oluşturur veya bir fluorophore heyecanlandıran ikinci bir tepki ATP fosfat bağı hidroliz kaplin tarafından kinaz etkinliğini izlemek için birkaç yöntem vardır, ama bu tepkiler birden çok hareketli parçalar ve -ebilmek var olmak Lojistik10zor. Özellikle fosfor-devret etkinliği ölçmek için en kolay yolu doğrudan radiolabeled fosfat grubu transferi bir piyasada bulunan γ –32-P izlemektir bir sigara radiolabeled substrat11 NTP habercisi , 12 , 13. karışımları radiolabeled yüzeylerde ve ürünleri ayrılmış ve ince tabaka Kromatografi (TLC) sayılabilir. TLC solutes verilen bir çözücü içinde fark hareketliliğini kılcal eylem tarafından üzerine adsorbe14solutes karışımı olmuştur bir yüzey üzerinde (katı faz) geçirmek çözücü (sıvı faz) izin vererek kullanır. Küçük ve/veya eksikliği katı faz ile olumlu etkileşimler solutes göç solutes daha yüksek moleküler ağırlık veya masif büyük benzeşim ile daha ilk konumlarından daha uzun mesafeler. Fosfor-devret sınavına fosfat moieties eklenir ve nötr veya asidik pH11,12,14, negatif iyon yük eklemek molekül molekül ağırlığı artırmak. Bu onların hareketlilik PEI-selüloz gibi temel bir yüzeyi azaltır. Asidik potasyum fosfat arabellekte zaman, karışımları mono-, di-, tri-, tetra-ve pentaphosphate türler PEI-selüloz üzerinde miktar her türün (Şekil 2, Şekil 3) izin, kolayca ayrılabilir. Faiz enzim içeren hücre lysates kullanarak bu tür deneyleri yapılabilir ama bu substrat ve/veya ürün tüketmek için diğer kinaz, fosfatazlar ve genel ATPases aktivite olasılığını içerir. Enzim aktivitesinin kantitatif vitro değerlendirilmesi için faiz enzim arındırmak gereklidir.
Guanozin tetrafosfat (ppGpp) ve guanozin pentaphosphate (pppGpp) olan, sırasıyla, bir pirofosfat havalesi ile oluşan moleküller grup bir adenozin trifosfat (ATP) öncül bir guanozin nükleotittir (GSYİH) sinyal ribonucleotide veya guanozin tetrafosfat (GTP) substrat15. Topluca (p) ppGpp bilinen bu tek ribonucleotide sinyaller, çevresel stres farklı bakteri türleri15,16katı yanıt olarak bilinen bir hücre genelinde yanıt aracılık. Enzimlerin iki korunmuş sınıf katalizler oluşumu (p) ppGpp15,17 ‘ Rel/DPT homolog (RSH) enzimlerdir ‘uzun’ bifonksiyonel (p) ppGpp sentetaz/Hidrolazlar onların benzerlik Real ve SpoT (p) adlı ppGpp metabolik küçük alarmone sentetaz (SAS) enzimler sadece Gram pozitif bakteri15‘ te, bulunan kısa monofunctional sentetaz iken sentetaz, hidrolaz ve Düzenleyici etki alanlarını içeren enzimler Escherichia coli üzerinden 17 , 18. spor oluşturmayan gram-pozitif bakteri Clostridium difficile sözde RSH ve SA’ları genler19kodlar. Burada, C. difficile RSH enzim catalytically etkin (p) ppGpp sentetaz olduğundan emin olun ilk etkinlik deneyleri mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada onun öğesini RSH dan C. difficile arıtma raporu ve radiolabeled ince tabaka Kromatografi kullanarak faaliyet miktar için bir yöntem mevcut. Bu yöntem daha önce diguanylate cyclase enzim C. difficile, yanı sıra (p) ppGpp sentetaz, nükleotit cyclase, kinaz ve diğer organizmalar11,12 fosfodiesteraz enzim etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır ,13,21</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIAID 1K22AI118929-01 tarafından finanse edildi. EBP Old Dominion University, Norfolk, Virginia, ABD araştırma Office bir yaz Araştırma Bursu Programı hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
