Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile
Summary
Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.
Abstract
Enzimas quinasa y pyrophosphokinase transfieren del fosfato gamma o la molécula de pirofosfato beta-gamma a partir de precursores de nucleótidos trifosfato a sustratos para crear productos fosforilados. El uso de la γ –32– P etiquetado precursores NTP permite supervisión simultánea de formación de producto y utilización del sustrato por la radiografía. Cromatografía en capa fina (TLC) en las placas de celulosa permite la rápida separación y cuantificación sensible de sustrato y producto. Se presenta un método para la utilización de la cromatografía en capa fina para analizar la actividad pyrophosphokinase de una sintetasa purificada de ppGpp (p). Este método se ha utilizado anteriormente para caracterizar la actividad de sintetasas de nucleótido y dinucleótido cíclicos y es ampliamente conveniente para caracterizar la actividad de cualquier enzima que hidroliza un enlace de nucleótidos trifosfato o transfiere un terminal fosfato a partir de un donante de fosfato a otra molécula.
Introduction
Enzimas quinasa y pyrophosphokinase (o diphospho-quinasa) transferencia de fosfatos a partir de precursores de nucleótidos trifosfato (NTP) a las moléculas de sustrato. Los sustratos pueden incluir otros nucleótidos, aminoácidos o proteínas, carbohidratos y lípidos1. Análisis Bioinformático a veces pueden predecir una enzima cognada sustrato o sustratos basados en la semejanza a las enzimas caracterizadas, pero validación experimental sigue siendo necesario. Del mismo modo, la afinidad de una enzima para sus substratos y la tasa a la que cataliza la reacción de transferencia de fósforo y los efectos de factores inhibidores y otros efectores de la enzima deben ser determinada experimentalmente. Para evitar el agotamiento del precursor del ATP por otras enzimas ATP-consumo presentes en el citoplasma bacteriano, ensayos de actividad cuantitativa requieren proteínas purificadas.
Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad metálica ha sido cubierto completamente en la literatura2,3. Etiquetas de la histidina que consta de seis residuos de histidina consecutivos anexados a la N – o C-terminal de una proteína recombinante permiten rápida purificación por cromatografía de afinidad metálica4,5,6. Estas secuencias son pequeñas comparadas a las proteínas modifican y suelen tener un efecto mínimo en función de la proteína, aunque a veces puede alterar la estabilidad de la proteína o enzima cinética7,8. Etiquetas de histidina en la N – y C-termini de la misma proteína pueden tener diversos efectos, que son difíciles de predecir sin conocer la estructura de la proteína en cuestión. Etiquetas de la histidina se incorporan típicamente durante la clonación de una proteína recombinante mediante el diseño de primers que codifican seis residuos de histidina, ya sea inmediatamente 3′ al codón de inicio ATG o inmediatamente 5′ al codón de parada del marco abierto de lectura. Después de la amplificación, el gen que contiene hexahistidine es ligado en un vector bajo el control de un promotor inducible y expresado, típicamente en una cepa de laboratorio de e. coli. La proteína de recombinación entonces puede ser aislada en una resina de afinidad que contienen cationes divalentes inmovilizados (generalmente níquel o cobalto)9. Natales metal vinculante proteínas contaminantes pueden eliminarse por titulación con imidazol, que desplaza competitivamente proteína encuadernada2. Finalmente, la proteína Diana es eluida de la columna con altas concentraciones de imidazol. Hay varias fuentes comerciales para las resinas de catión metal inmovilizados, y los fabricantes ofrecen recomendaciones para las condiciones de buffer y concentraciones de imidazol. Después de elución, la proteína puede ser analizada por electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE), dializaron o utilizada inmediatamente en análisis funcionales.
Hay varios métodos para monitorear indirectamente actividad quinasa por acoplamiento hidrólisis de enlace de fosfato de ATP a una segunda reacción que libera o excita un fluoróforo o genera la quimioluminescencia, pero estas reacciones tienen varias partes móviles y pueden ser logísticamente difíciles10. La manera más directa para medir específicamente la actividad de transferencia de fósforo es monitorizar directamente la transferencia de un grupo fosfato radiomarcada de un γ disponibles comercialmente –32-P precursor NTP a un sustrato no radiactiva11 , 12 , 13. mezclas de sustratos radiactivos y productos pueden ser separados y cuantificados por cromatografía en capa fina (TLC). TLC utiliza la movilidad diferencial de los solutos en un solvente dado, permitiendo que el solvente (fase líquida) que migra por acción capilar a través de una superficie (fase sólida) sobre el cual una mezcla de solutos ha sido adsorbido14. Solutos que son pequeñas y carecen de interacciones favorables con la fase sólida se migran largas distancias desde su ubicación inicial a solutos con peso molecular mayor o gran afinidad por el sólido. Para el examen de transferencia de fósforo, partes de fosfato aumentan el peso molecular de las moléculas que se agregan a y agregar la carga iónica negativa a pH neutro o acídico11,12,14. Esto disminuye su movilidad sobre superficies básicas como PEI-celulosa. Cuando se convirtió en tampón de fosfato ácido de potasio, mezclas de mono-, di-, tri-, tetra- y especies pentaphosphate pueden dividirse fácilmente en PEI-celulosa, permitiendo la cuantificación de cada especie (figura 2, figura 3). Estos ensayos se pueden realizar lysates de la célula que contiene la enzima de interés, pero esto incluye el potencial de la actividad de otras quinasas, fosfatasas y ATPasas general a agotar el sustrato o producto. Una cuantitativa en vitro la evaluación de la actividad enzimática, es necesario purificar la enzima de interés.
Guanosina tetraphosphate (ppGpp) y guanosina pentaphosphate (pppGpp) son ribonucleótido señalización moléculas formadas por la transferencia de un pirofosfato grupo de un precursor de la adenosina trifosfato (ATP), respectivamente, un difosfato de guanosina (PIB) o guanosina tetraphosphate (GTP) sustrato15. Estas señales solo ribonucleótido, conocidas colectivamente como (p) ppGpp, median una respuesta todo el celular a la tensión ambiental, conocida como la respuesta estricta en diversas especies bacterianas15,16. Dos clases conservadas de enzimas catalizan la formación de (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homólogo (RSH) enzimas son ‘largo’ bifuncional (p) ppGpp sintetasa/hidrolasas, nombrado para su semejanza a la RelA y punto (p) ppGpp metabólica enzimas de Escherichia coli que contienen sintetasa, hidrolasa y dominios de regulación, mientras que el pequeño alarmone sintetasa (SAS) enzimas son monofuncionales corto sintetasas exclusivamente encontradas Gram positivas bacterias15, 17 , 18. la bacteria gram positiva formadoras de esporas de Clostridium difficile codifica supuestos genes RSH y SAS19. Aquí, presentamos el análisis de la actividad inicial que confirman que la enzima de C. difficile RSH es una catalítico activa sintetasa de ppGpp (p).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí divulgamos la purificación de su etiquetado RSH de C. difficile y presentar un método para la cuantificación de la actividad utilizando cromatografía en capa fina radiactivos. Este método se ha utilizado anteriormente para evaluar la actividad de enzimas de Diguanilato ciclasa de C. difficile, como ligasa de (p) ppGpp, ciclasa de nucleótido, quinasa y las enzimas fosfodiesterasa de otros organismos11,12 ,<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por NIAID 1K22AI118929-01. EBP fue apoyado por una beca para programa de beca verano investigación de la oficina de investigación en Old Dominion University, Norfolk, Virginia, Estados Unidos.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
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