Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.
Abstract
As técnicas de imagem com base em fluorescência, em combinação com a evolução da microscopia de luz, revolucionaram a forma como os biólogos celulares realizam estudos de imagem celular ao vivo. Os métodos para detectar RNAs expandiram-se extremamente desde que os estudos seminal lig a localização local-específica do mRNA ao Regulamento da expressão genética. Os processos dinâmicos do mRNA podem agora ser visualizados através das aproximações que detectam mRNAs, acoplados com os set-ups da microscopia que são rápidos bastante capturar a escala dinâmica do comportamento molecular. A tecnologia de baliza molecular é uma abordagem baseada em hibridação capaz de detecção direta de transcrições endógenas em células vivas. As balizas moleculares são sondas de ácido nucleico discriminante, em forma de hairpin, extinto internamente, mononucleotídeo, que fluorescência somente após a hibridação a uma sequência de alvos única. Quando acoplados com a microscopia de fluorescência avançada e a imagem latente de alta resolução, permitem que um realize o seguimento espacial e temporal do movimento intracelular de mRNAs. Embora essa tecnologia seja o único método capaz de detectar transcrições endógenas, os biólogos celulares ainda não adotaram totalmente essa tecnologia devido às dificuldades de projetar tais sondas para imagens de células ao vivo. Uma aplicação de software nova, pinmol, permite o projeto realçado e rápido das pontas de prova seridas melhor para hibridizam eficientemente às regiões do alvo do mRNA dentro de uma pilha viva. Além disso, a aquisição de imagem de alta resolução, em tempo real e o software de análise de imagens de código aberto, permitem uma saída de dados refinada, levando a uma avaliação mais fina da complexidade subjacente aos processos dinâmicos envolvidos no ciclo de vida do mRNA.
Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para projetar e entregar balizas moleculars em câmaras do ovo do melanogaster de Drosophila . A deteção e o visualização diretos e altamente específicos de mRNAs maternos endógenos são executados através da microscopia confocal do disco giratório. Os dados da imagem latente são processados e analisados usando a deteção e o seguimento do objeto no software gelado para obter detalhes sobre o movimento dinâmico dos mRNAs, que são transportados e localizados às regiões especializadas dentro do oocyte.
Introduction
Estudos de biologia celular que visualizam eventos dinâmicos com resolução espacial e temporal foram possibiliados pelo desenvolvimento de técnicas de imagens de células ao vivo baseadas em fluorescência. Atualmente, in vivo mRNA visualização é alcançada através de tecnologias que são baseadas em interações RNA aptamer-proteína, RNA aptamer-induzida por fluorescência de corantes orgânicos e ácido nucleico sonda de recozimento1,2, 3. They todos oferecem a especificidade elevada, a sensibilidade e a relação do sinal-à-fundo. No entanto, as abordagens centradas no RNA requerem manipulação genética extensiva, onde um transgene é projetado para expressar um RNA com motivos estruturais artificiais que são necessários para a ligação de proteínas ou corantes orgânicos. Por exemplo, o sistema MS2/MCP requer a coexpressão de um transgene expressando uma construção de RNA contendo múltiplas repetições em tandem da seqüência de ligação para a proteína de revestimento de bacteriófago MS2 (MCP), e outro transgene que codifica uma proteína fluorescente fundido para MCP4,5. A adição de tais motivos estruturais secundários ao RNA, junto com um volumoso cDNAs marcou a proteína, levantou as preocupações que os processos nativos do RNA podem ser afetados6. Uma tecnologia que aborda essa preocupação e oferece vantagens exclusivas adicionais é a abordagem baseada em ácido nucleico, balizas moleculares (MBs). MBS permitem a detecção multiplex de mRNAs endógenas, discriminação de variações de nucleotídeo único e cinética rápida de hibridação com mRNA alvo7,8. Os MBs são sondas de oligonucleotídeo que permanecem em uma prega de hairpin extinto antes de sofrer uma mudança conformacional fluorogênica, uma vez que eles hibridizam para seus alvos (Figura 1C)9. Diversos grupos tiveram o sucesso em usar MBS para detectar ambos não-codificando RNAs (microRNAs e lncrnas) 10,11,12,13, retrovirus14 do RNA e ADN-proteína dinâmica interações15. Foram empregados com sucesso para a imagem latente em vários organismos e tecidos, tais como embriões do zebrafish16, neurônios13, o tecido17do tumor, diferenciando os cardiomiócitos18, e as salmonelas a 19.
Aqui nós descrevemos a aproximação do projeto, da entrega e da deteção para mRNAs endógenos em câmaras de ovo vivas do D. melanogaster acopladas com uma estrutura da microscopia que seja rápida bastante capturar a escala dinâmica do transporte molecular ativo. A câmara do ovo de D. melanogaster serviu como um sistema modelo multicelular ideal para uma escala larga de estudos desenvolventes, da divisão adiantada da pilha de haste do germline e da expressão genética materna à geração do plano segmentar20do corpo, a 21. As câmaras de ovo são facilmente isoladas, grandes e translúcidas, e capazes de suportar horas de análise ex vivo , tornando-os altamente aptos a experimentos de imagem. Muito trabalho centrou-se na localização assimétrica das transcrições maternas a regiões subcelulares discretas antes de serem traduzidas ativamente. No detalhe, a localização de Oskar mRNA e sua tradução subseqüente no pólo do posterior do oocyte devem ocorrer em uma maneira firmemente regulada para evitar um phenotype bicaudal letal do embrião22. Oskar mRNA é transcrito nas 15 células germinais, denominadas células de enfermagem, e transportada ativamente através de pontes citoplasmáticas, denominadas canais de anel, para o oócito, a célula germinativa que se torna o ovo maduro e é finalmente fertilizado (Figura 1a ). A quantidade considerável de informações já disponíveis sobre o recrutamento dinâmico e a troca de fatores proteicos de e para Oskar mrnp, juntamente com sua viagem intracelular de longo alcance, fazem de Oskar um candidato preferencial para estudar os muitos processos do ciclo de vida do mRNA. Os MBs têm sido fundamentais para revelar detalhes sobre o processo de localização de mRNA e decifrar a regulação e a função de fatores proteicos que controlam o transporte de mRNA durante a Drosophila oogenesis. Em particular, por microinjetar MBS em células de enfermeira e realizando experimentos de imagens de células ao vivo, o rastreamento de mRNAs endógenas é possível8,23.
O roteiro aqui apresentado oferece as etapas de um processo completo, desde a realização de um experimento de imagens de células ao vivo usando MBs, adquirindo dados de imagem, até a realização de análises de dados para rastrear o mRNA endógeno em seu ambiente celular nativo. As etapas podem ser modificadas e otimizadas para atender às necessidades dos pesquisadores que trabalham com outros tecidos/tipos de células dentro de seu próprio ambiente de laboratório.
Protocol
Representative Results
Discussion
A visualização ao vivo do tráfico endógeno de mRNA em câmaras de ovos de Drosophila depende do uso de MBS específicos, eficientes e resistentes a nucleases, que agora podem ser facilmente projetados com o software pinmol . Os MBs são sondas específicas projetadas para detectar sequências exclusivas dentro de um mRNA alvo (preferencialmente regiões livres de estrutura secundária), possibilitando uma detecção altamente resolvida de uma transcrição. A única limitação ao adotar esta técni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Salvatore AE Marras (centro do Instituto de pesquisa em saúde pública, Universidade Rutgers) pela síntese, rotulagem e purificação de balizas moleculares, e Daniel St Johnston (Instituto Gurdon, Universidade de Cambridge) para o Oskar-MS2/ Estoque de mosca transgênica MCP-GFP. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de carreira da Fundação Nacional de ciência 1149738 e um Congresso de pessoal profissional-prêmio CUNY para DPB.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
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