Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.
Abstract
Fluorescentie-gebaseerde beeldvormingstechnieken, in combinatie met ontwikkelingen in lichte microscopie, hebben een revolutie teweeggebracht in de manier waarop celbiologen Live-celbeeldvormings onderzoeken uitvoeren. De methoden voor het opsporen van Rna’s zijn sterk toegenomen sinds de seminale studies de locatiespecifieke mRNA-lokalisatie hebben gekoppeld aan de genexpressie verordening. Dynamische mRNA-processen kunnen nu worden gevisualiseerd via benaderingen die Mrna’s detecteren, in combinatie met microscopie-opstellingen die snel genoeg zijn om het dynamische bereik van moleculair gedrag vast te leggen. De moleculaire baken technologie is een hybridisatie gebaseerde benadering die in staat is om de endogene transcripten in levende cellen direct te detecteren. Moleculaire bakens zijn haarspeld vormige, intern quenched, single-nucleotide discriminerende nucleïnezuur sondes, die alleen fluoresceren bij hybridisatie tot een unieke doel sequentie. In combinatie met geavanceerde fluorescentiemicroscopie en hoge resolutie beeldvorming, kunnen ze een ruimtelijke en temporele tracking van intracellulaire beweging van Mrna’s uitvoeren. Hoewel deze technologie de enige methode is die in staat is om endogene transcripten te detecteren, hebben celbiologen deze technologie nog niet volledig omarmd vanwege moeilijkheden bij het ontwerpen van dergelijke sondes voor Live-celbeeldvorming. Een nieuwe softwaretoepassing, Pinmol, zorgt voor een verbeterd en snel ontwerp van sondes die het meest geschikt zijn om efficiënt te hybridiseren naar mRNA-doelgebieden binnen een levende cel. Bovendien, hoge resolutie, real-time beeld verwerving en huidige, open source beeldanalyse software zorgen voor een verfijnde data-output, wat leidt tot een fijnere evaluatie van de complexiteit van de dynamische processen die betrokken zijn bij de levenscyclus van de mRNA.
Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het ontwerpen en leveren van moleculaire bakens in Drosophila melanogaster Eier kamers. Directe en zeer specifieke detectie en visualisatie van endogene maternale Mrna’s wordt uitgevoerd via draaiende schijf confocale microscopie. Imaging gegevens worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van objectdetectie en tracking in Icy software om informatie te verkrijgen over de dynamische verplaatsing van Mrna’s, die worden vervoerd en gelokaliseerd in gespecialiseerde gebieden binnen de eicel.
Introduction
Celbiologie studies die dynamische gebeurtenissen visualiseren met ruimtelijke en temporele resolutie zijn mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescentie-gebaseerde Live Cell Imaging technieken. Momenteel wordt in vivo mRNA-visualisatie verkregen via technologieën die zijn gebaseerd op RNA aptamer-eiwit interacties, RNA aptamer-geïnduceerde fluorescentie van organische kleurstoffen en nucleïnezuur sondegloeien1,2, 3. ze bieden allemaal een hoge specificiteit, gevoeligheid en signaal-naar-achtergrond ratio. RNA aptamer-gecentreerde benaderingen vereisen echter uitgebreide genetische manipulatie, waarbij een transgen is ontworpen om een RNA uit te drukken met kunstmatige structurele motieven die nodig zijn voor eiwitten of organische kleurstof binding. Het MS2/MCP-systeem vereist bijvoorbeeld de co-expressie van een transgen dat een RNA-constructie met meerdere tandem herhalingen van de bindings sequentie voor de bacteriofaag ms2 Coat protein (MCP) en een ander transgen codeert met een fluorescerende proteïne gesmolten tot MCP4,5. De toevoeging van dergelijke secundaire structurele motieven aan het RNA, samen met een volumineus fluorescendig gelabeld eiwit, heeft bezorgdheid geuit dat inheemse RNA-processen kunnen worden beïnvloed6. Een technologie die deze bezorgdheid behandelt en extra unieke voordelen biedt, is de op nucleïnezuur gebaseerde benadering, moleculaire bakens (MBs). MBS zorgen voor de multiplex detectie van endogene mrna’s, discriminatie van enkelvoudige nucleotide variaties, en snelle kinetiek van hybridisatie met target mRNA7,8. MBs zijn oligonucleotide-sondes die in een afgestelde haarspeld plooi achterblijven voordat ze een fluorogene conformationele verandering ondergaan zodra ze hun doelen hybridiseren (figuur 1c)9. Verschillende groepen hebben succes gehad met het gebruik van MBS om zowel niet-Codeer rna’s (microRNAs en lncrnas) te detecteren10,11,12,13, RNA retrovirussen14 en dynamische DNA-eiwitten interacties15. Ze zijn met succes gebruikt voorbeeld vorming in verschillende organismen en weefsels, zoals zebravis embryo’s16, neuronen13, tumorweefsel17, differentiërende cardio myocytes18, en salmonella 19.
Hier beschrijven we de ontwerp-, leverings-en detectie benadering voor endogene Mrna’s in Living D. melanogaster Eier kamers in combinatie met een microscopie set-up die snel genoeg is om het dynamische bereik van actief moleculair transport vast te leggen. De D. melanogaster Eier kamer heeft gediend als een ideaal multicellulair modelsysteem voor een breed scala aan ontwikkelingsstudies, van vroege kiembaan stamcel deling en maternale genexpressie tot de generatie van het segmentale Body plan20, 21. Eier kamers zijn gemakkelijk geïsoleerd, groot en doorschijnend en kunnen uren van ex- vivo -analyse weerstaan, waardoor ze zeer vatbaar zijn voor Imaging-experimenten. Veel werk heeft zich geconcentreerd op de asymmetrische lokalisatie van moederlijke transcripten aan discrete subcellulaire regio’s voordat ze actief werden vertaald. In het bijzonder moet de lokalisatie van Oskar mRNA en de daaropvolgende vertaling ervan op de achterste pool van de eicel op een strak geregelde wijze plaatsvinden om een dodelijk bicaudale embryo-fenotype22te vermijden. Oskar mRNA wordt getranscribeerd in de 15 kiembaan cellen, verpleegkundige cellen genoemd, en actief getransporteerd door cytoplasmische bruggen, zogenaamde ring grachten, in de eicel, de germlijncel die het volwassen ei wordt en is uiteindelijk bevruchte (Figuur 1a ). De aanzienlijke hoeveelheid informatie die al beschikbaar is met betrekking tot de dynamische werving en uitwisseling van eiwit factoren van en naar Oskar mrnp, samen met zijn lange-afstand intracellulaire reizen, maken van Oskar een voorkeurs kandidaat om te studeren de vele processen van de mRNA-levenscyclus. MBs zijn instrumentaal in het onthullen van Details over het proces van mRNA lokalisatie en het ontcijferen van de verordening en functie van eiwit factoren die controle mRNA transport tijdens Drosophila oogenesis. In het bijzonder, door het microinjecteren van MBS in verpleeg cellen en het uitvoeren van Live Cell Imaging experimenten, is het volgen van endogene mrna’s mogelijk8,23.
De roadmap die hier wordt gepresenteerd, biedt de stappen van een compleet proces, van het uitvoeren van een live-celbeeldvormings experiment met MBs, het verkrijgen van Imaging gegevens tot het uitvoeren van data-analyse om endogene mRNA in zijn native cellulaire omgeving te volgen. De stappen kunnen worden aangepast en verder geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers die werken met andere weefsels/celtypen binnen hun eigen lab-instelling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live visualisatie van endogene mRNA-handel in Drosophila Egg Chambers vertrouwt op het gebruik van specifieke, efficiënte en Nuclease-resistente MBS, die nu gemakkelijk met pinmol -software kunnen worden ontworpen. MBs zijn specifieke probes ontworpen voor het detecteren van unieke sequenties binnen een doel mRNA (bij voorkeur regio’s vrij van secundaire structuur), waardoor een zeer opgeloste detectie van een transcript. De enige beperking bij het aannemen van deze techniek/protocol voor andere weefse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) voor de synthese, etikettering en zuivering van moleculaire bakens, en Daniel St Johnston (het Gurdon Institute, University of Cambridge) voor de Oskar-ms2/ MCP-GFP transgene Fly Stock. Dit werk werd gesteund door een National Science Foundation CAREER Award 1149738 en een professionele staff Congress-CUNY Award voor DPB.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
- Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5′ to 3′ degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
- Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
- Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
- Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
- Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
- Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
- Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
- Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
- Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
- Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
- Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
- Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
- Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
- Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
- Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
- Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
- Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
- Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2′-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).
