Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

Summary

Con la presentennotità di un protocollo per misurare al capezzale l’attività di endotossina dei campioni di sangue intero umano. Il saggio Endotoxin Activity è un semplice test da eseguire e può essere un biomarcatore utile nei pazienti critici con sepsi.

Abstract

Il lipopolisasseride, noto anche come endotossina, è una componente fondamentale dei batteri gram-negativi e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della sepsi e dello shock settico. L’identificazione precoce di un processo infettivo che si sta rapidamente evolvendo verso una malattia critica potrebbe indurre un trattamento più rapido e più intensivo, portando così potenzialmente a migliori esiti per i pazienti. L’attività endotossina (EA) può essere utilizzato al capezzale come biomarcatore affidabile dell’endotossia sistemica. È stato ripetutamente dimostrato che la rilevazione di livelli elevati di attività endotossina sia associata ad un aumento della gravità della malattia nei pazienti con sepsi e shock settico. Il saggio è veloce e facile da eseguire. In breve, dopo il campionamento, un di sangue intero viene mescolato con un anticorpo anti-endotossina e con LPS aggiunto. L’attività dell’endotossina è misurata come la relativa raffica ossidativa di neutrofili innescati rilevati dalla chemioluminescenza. L’output del saggio è espresso su una scala da 0 (assente) a 1 (massimo) e classificato come “basso” (<0,4 unità), "intermedio" (0,4–0,59 unità) o "alto" (unità 0,6 USD). La metodologia dettagliata e la logica per l'attuazione del saggio EA sono riportate in questo manoscritto.

Introduction

Il Lipopolysaccharide (LPS), noto anche come endotossina, è un componente chiave della struttura della membrana dei batteri Gram-negativi (GN). Esso costituisce circa il 10% della parete cellulare, essendo vitale per l’integrità della membrana esterna e l’omeostasi. Inoltre, è un potente attivatore del sistema immunitario innato dell’ospite^1,2.

L’esposizione in vitro delle cellule del sistema immunitario innato a LPS porta a cambiamenti nell’espressione di più geni³. La somministrazione di piccole quantità di LPS in volontari umani sani innesca la cascata di infiammazione sistemica acuta, mentre la sepsi e lo shock settico possono insorgere con concentrazioni di endotossina più elevate^4,5.

La sepsi è una condizione pericolosa per la vita che, se non prontamente riconosciuta, può portare all’insufficienza multiorgano e alla morte. I pazienti settici devono essere trattati in modo tempestivo, con rianimazione aggressiva, terapia antibiotica adeguata, controllo ottimale del codice sorgente e strategie di supporto all’organo tempestivo. La diagnosi dell’eziologia della sepsi si basa principalmente sul riconoscimento clinico e sul rilevamento di patogeni basati sulla cultura⁶. Tuttavia, i risultati delle colture microbiche possono richiedere fino a 48 h e sono inconcludenti fino al 30% dei casi⁷. L’identificazione precoce e l’intervento possono portare a migliori esiti per i pazienti. Nei pazienti in cui si sospetta la sepsi, le decisioni sono spesso prese sulla base di parametri fisiologici e biochimici, senza un chiaro segno di endotossia.

La misurazione dell’attività endotossina (EA) può essere ottenuta mediante un saggio commerciale (vedi Tabella deimateriali) nel sangue intero. Può essere utilizzato come biomarcatore dell’endotossia sistemica per la stratificazione precoce della gravità della malattia, in particolare nei pazienti a rischio di sviluppare shock settico⁸. Il test è stato utilizzato per guidare la terapia dell’emoperfusione Polymyxin B in uno studio clinico in doppio cieco controllato da randomizzati in pazienti con shock settico⁹. Nei pazienti in stato di crisi, lo studio MEDIC ha mostrato un aumento dei livelli di EA da associare alla disfunzione di organi multipli, alla durata del soggiorno dell’unità di terapia intensiva (ICU) e alla mortalità¹⁰.

Sono stati sviluppati diversi saggi per rilevare l’endotossina. L’assaggio di Limulus Amoebocyte (LAL), sia come gel-clot, turbidimetrico, o test cromogenico, è stato finora il più frequentemente adottato per la stima dell’endotossina del siero. Si basa sulla capacità di endotossina per indurre la coagulazione dell’emolina del granchio a ferro di cavallo, Limulo polyphemus. Tuttavia, questo saggio ha alcune limitazioni in termini di specificità. In particolare, può anche essere attivato da prodotti microbici diversi dall’endotossina, come i componenti della parete cellulare fungina, e può essere inibito da varie proteine plasmatiche umane¹¹.

Durante l’ultimo decennio la misurazione di EA è stata sviluppata e convalidata come biomarcatore dell’endotossia circolante. Rispetto al test LAL, EA è più veloce e più facile da implementare in ambito clinico. Inoltre, è stato dimostrato di essere più preciso di LAL nel sangue intero, con una maggiore sensibilità e specificità, sia in vitro che in vivo¹².

Nonostante la sua implementazione iniziale come uno strumento diagnostico precoce per la rapida identificazione dei batteri GN come agenti causali di sepsi, il livello di EA è stato studiato anche come biomarcatore della gravità della malattia. In questo contesto, è stato dimostrato di essere particolarmente utile valutare lo stato di ipoperfusione a causa di malattie critiche in corso, come lo shock settico o la sindrome da arresto post-cardiaco¹³. Più recentemente, dopo lo sviluppo di sistemi di emopurazione, è stato proposto anche un risultato positivo di EA come strumento di screening per identificare con precisione i potenziali candidati per tale terapia¹⁴. Recentemente abbiamo condotto uno studio retrospettivo osservazionale sulla prevalenza e l’importanza clinica dei primi livelli di EA in 107 pazienti con shock settico. In linea con altri risultati recenti, abbiamo scoperto che EA è un promettente marcatore della gravità della malattia nei pazienti con shock settico¹⁵.

Lo scopo del presente manoscritto è descrivere il metodo per eseguire il saggio EA, sia al capezzale che in laboratorio, e descriverne l’uso potenziale in uno scenario rappresentativo di shock settico. Questa tecnica è in grado di rilevare l’attività di LPS misurando l’esplosione ossidativa avanzata nei neutrofili in seguito al loro innesco da complessi di un anticorpo anti-endotossina e LPS. L’aumento dell’esplosione respiratoria viene rilevato da un chemiluminometro e la quantità di luce emessa è considerata proporzionale alla quantità di endotossina nel campione di sangue. Il saggio richiede pochi reagenti, richiede circa 30 min per eseguire eutilizza appena 40 .

Protocol

Il protocollo è condotto secondo le linee guida istituzionali relative alla gestione delle biocampioni umane e seguendo le attuali procedure operative standard del nostro laboratorio clinico. L’uso dei dati EA e delle informazioni cliniche dei pazienti testati segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione. 1. Attrezzature di laboratorio e contenuti del kit di anamante Conservare il kit EA a 2-8 gradi centigradi quando non è in uso. …

Representative Results

Un uomo di 72 anni è stato ricoverato al Pronto Soccorso (ED) di un ospedale urbano accademico. Pochi giorni prima si era presentato al suo medico di base lamentandosi di bruciare la minzione. È stata raccomandata una terapia a breve corso con fosforomicina orale. La sua storia medica includeva l’ipertensione, il diabete non complicato di tipo 2 e l’iperplasia prostatica benigna. I suoi farmaci includevano enalapril, atorvastatina, tamsulosin e metformina. <p class="jove_content" fo…

Discussion

Lo shock settico è ancora oggi associato a una mortalità fino al 40%, anche se questo tasso varia a seconda dei rapporti considerati¹⁶. La necessità di biomarcatori nuovi e migliori è sostenuta dalla maggior parte degli esperti del campo al fine di aiutare i medici nella diagnosi precoce, una migliore gestione e la prognosticazione dei pazienti con shock settico⁶.

L’esecuzione di un test EA non richiede conoscenze tecniche precedenti o sofist…

Materials

EAA kit	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL	Berthold	EAASL	Luminometer
Incubator shaker	GRANT	ES-20	Mini-incubator shaker
Vortexer	VWR	444-2790	Vortex instrument