Разгадке ключевые игроки гуморального иммунитета: Расширенный и оптимизированный протокол лимфоцитов изоляции от патчи Пейера в мышиных
Summary
В этом исследовании мы представляем Роман и эффективного протокола для изоляции лимфоциты от Пейера (PPs), которые могут быть впоследствии использованы в vivo и in vitro функциональных анализов, а также поток гранулярных исследования фолликулярной T вспомогательные и зародышевого центра B клетки.
Abstract
В слизистой оболочке кишечника иммунные клетки представляют собой уникальный иммунологические сущности, которая способствует иммунной толерантности при одновременно присвоении иммунной обороны против патогенов. Хорошо известно, что Пейера (PPs) играют важную роль в слизистой иммунной сети хостинг нескольких эффекторных T и B клетки подмножеств. Некоторая часть этих клеток-эффекторов, фолликулярная Т-хелперов (ЦГЗ) и клетки B зародышевого центра (GC) профессиональную в регуляции гуморального иммунитета. Таким образом характеристика эти подмножества ячеек в PPs с точки зрения их дифференциации программы и функциональных свойств могут обеспечить важную информацию о слизистой иммунитета. С этой целью легко применимые, эффективной и воспроизводимый метод лимфоцитов изоляции от PPs будет ценным для исследователей. В этом исследовании мы стремились создать эффективный метод для изоляции лимфоцитов из PPs мыши с высоким клетки доходности. Наш подход показал, что первоначальный ткани, обработки, например использование пищеварительной реагентов и ткани агитации, а также ячейки окрашивание условий и выбор панелей антитела, имеют большое влияние на качество и личность изолированных лимфоцитов и на экспериментальные результаты.
Здесь мы описываем протокол позволяет исследователям эффективно изолировать популяций лимфоцитов из PPs, позволяя воспроизводимого потока цитометрии-оценки на основе подмножеств T и B cell, сосредоточиваясь в первую очередь на TFH и GC B подмножества ячеек.
Introduction
Всего желудочно-кишечного тракта от начала до конца палубных с обширной сетью лимфоидной, содержащий иммунных клеток, больше чем любой другой орган человека и мыши1. Пейера в патчи (PPs) являются одним из основных компонентов кишечника отделения этой клеточных иммунных Организации, так называемые кишечнике связанных лимфоидной ткани (GALT)2,3. В PPs, тысячи миллионов антигенов, производный от пищевых материалов, синантропных микробиоту и патогенов будучи непрерывно, и при необходимости соответствующие иммунных реакций к ним смонтированные таким образом поддерживая кишечной иммунной гомеостаз. В этом смысле PPs может называться «миндалин кишечника». PPs состоят из основных суб отсеков: Субэпителиальная купол (SED), большие зоны B-клеток фолликула; эпителия вышележащих связанные фолликула (инженер) и межфолликулярных области (IFR) где T-клетки расположены4. Этот уникальный дробления PPs позволяет различных эффекторных клеток подмножеств сотрудничать, таким образом, наделяет туберкулина в кишечнике.
PPs не хватает афферентные лимфатические, и по этой причине, антигены, перевезены в PPs из тонкой кишки не проводятся через лимфатические сосуды в отличие от большинства других лимфоидных органов. Вместо этого специализированные эпителиальные клетки, расположенные в фей, так называемые M клеток, отвечают за передачу Люминал антигенов в PPs5. Впоследствии, перевозимых антигены подобрал дендритных клеток (DCs) и фагоциты, которые расположены в регионе Субэпителиальная купол (SED) под FAE6,7. Этот процесс сортировки антигена, DCs в PP важно инициировать адаптивного иммунного ответа8 и последующее поколение IgA, секреции клетки9.
Из-за антигенные бремя от синантропных флоры и пищевых материалов PPs хост эндогенно активированного эффекторных T и клетки B подмножества в большой обилия например TFH и IgA+ GC B клеток10, предложив, что PPs представляют сайт активной иммунной 11ответ. Обнаружение до 20-25% TFH клетки в течение всего CD4+ T Мобильный отсека и до 10 – 15%, GC B клетки в течение всего клетки B возможен в PPs, собранных от неиммунизированных молодых мышей C57BL/612. В отличие от других типов вспомогательные клетки T (т.е., Th1, Th2, Th17 клетки), TFH клетки показывают уникальные тропизм в клетки B фолликулы главным образом благодаря CXCR5 выражение, которое способствует TFH клеток самонаведения вдоль градиента CXCL1313. В зонах B клеток фолликула PPs TFH клетки вызывают рекомбинации переключатель класса IgA и соматические Гипермутационный в активированные клетки B, из которых высокоспецифичные IgA производства клеток дифференцировать14. Впоследствии эти антитела секретирующих плазматических клеток миграции propria пластинки (LP) и регулировать иммунного гомеостаза в кишечнике10.
Определение и характеристика TFH и GC B клеточных популяций в PPs может позволить исследователей для изучения динамики гуморального иммунного ответа в условиях устойчивого состояния без необходимости длительной иммунизации моделей традиционно используется в TFH-GC B клеток исследования15,16,17,18. Анализируя TFH клетки в PPs не так просто, как другие клетки подмножеств. Технические проблемы включают в себя выявление условий приготовления идеальной ткани, поверхности антитела маркер комбинация, а также выбрав соответствующие положительной и отрицательной контроля. TFH и PP поля исследования демонстрируют большое разнообразие с точки зрения экспериментальной процедуры и далеки от наделения консенсуса для установления стандартизованных протоколов по нескольким причинам. Во-первых каждого подмножества ячеек в пределах PPs, как правило, быть затронуты дифференциально условий приготовления тканей, требующих дальнейшего изменения подмножества конкретным образом клетки. Во-вторых существует значительное расхождение среди сообщаемых методов относительно деталей подготовка клетки от PPs. третьего, количество на основе протокола сравнительных исследований, изучения методов подготовки идеально тканей и экспериментальных условий для PP и ЦГВЗ исследования является довольно ограниченной.
Текущие исследования на основе протокола предложил для PP ячейки подготовка19,20,21,22 были не TFH – или GC клетки B ориентированный. Кроме того, были найдены некоторые условия подготовки ткани, рекомендуется для PPs19,20 , например на основе коллагеназы пищеварение негативно повлияли на результат идентификации TFH подачей cytometry18. Исходя из этого мы полагали, что оптимизированные, стандартизированных и воспроизводимые протокол, который может использоваться для изучения TFH и GC B динамика клеток в PPs будет ценным для следователей, работающих по этой теме. Эта потребность дал нам стимул для создания улучшение и современный протокол для изоляции и характеристика лимфоцитов PP, мелко оптимизированную для клеточного восстановления, жизнеспособности и эффективности для потока гранулярных характеристика несколько T и B подмножества ячеек. Мы также стремились исключить несколько трудоемкий подготовительных шагов, предложенных в предыдущих протоколах, таким образом, снижая необходимые манипуляции и времени для подготовки ткани и клетки от PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол, оптимизированный для потока характеристика гранулярных клеток TFH и GC B. Одним из основных преимуществ нашего протокола является, что он позволяет изоляции до 107 (в среднем 4-5 х 106 клеток) всего PP клеток из одной мыши (штамм C57BL/6) без каких-либо процес?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Лаура Штраус и Питер Sage за полезные обсуждения и поддержки с cytometry анализ потоков.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
