Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches
Summary
Neste estudo, apresentamos uma nova e eficaz protocolo para a isolação de linfócitos de remendos de Peyer (PPs), que podem ser usados posteriormente para ensaios funcionais in vivo e in vitro , bem como estudos de fluxo cytometric t folicular auxiliar e células B de centro germinativo.
Abstract
Na mucosa do intestino, células do sistema imunológico constituem uma entidade imunológica exclusiva, que promove a tolerância imunológica ao mesmo tempo conferindo simultaneamente a defesa imunológica contra agentes patogénicos. Está bem estabelecido que de Peyer (PPs) têm um papel essencial na rede imune mucosal hospedando vários efetores T e células B subconjuntos. Uma certa fração dessas células efetoras, folicular T helper (TFH) e as células B do centro germinativo (GC) estão profissionalizando na regulação da imunidade humoral. Daí, a caracterização destes subconjuntos de célula dentro de PPs em termos de programa de diferenciação e propriedades funcionais pode fornecer informações importantes sobre a imunidade da mucosa. Para este fim, um método facilmente aplicável, eficiente e reprodutível de isolamento de linfócitos de PPs seria valioso para os pesquisadores. Neste estudo, tivemos como objetivo gerar um método eficaz para isolar linfócitos de rato PPs com rendimento elevado célula. Nossa abordagem revelou que o tecido inicial de processamento tais como o uso de reagentes digestivos e agitação de tecido, bem como coloração condições e seleção dos painéis de anticorpo celular, têm grande influência sobre a qualidade e a identidade dos linfócitos isolados e em resultados experimentais.
Aqui, descrevemos um protocolo que permite aos investigadores eficientemente isolar populações de linfócitos de PPs permitindo avaliação baseada em citometria de fluxo pode ser reproduzido de subconjuntos T e células B, principalmente focando TFH e GC B subconjuntos de célula.
Introduction
O trato gastrointestinal inteiro desde o início até o fim é adornado com uma extensa rede linfoide que contém células do sistema imunológico, mais do que qualquer outro órgão em humanos e rato1. Peyer do patches (PPs), constituem um componente importante do ramo intestinal desta organização imune celular, tecido linfoide associado intestino so-called (GALT)2,3. Dentro de PPs, milhares de milhões de antígenos derivados de matérias alimentares, microbiota comensal e patógenos estão sendo amostrados continuamente, e quando necessárias respostas adequadas do imunológico em direção a eles são montado assim manter imune intestinal homeostase. Nesse sentido, o PPs poderiam ser nomeados como “as amígdalas do intestino”. PPC consiste em grandes compartimentos sub: cúpula subepithelial (SED), grandes zonas de folículo de células B; o epitélio sobrejacente do folículo-associado (FAE) e região interfollicular (IFR) onde as células T estão localizados4. Este exclusiva compartimentalização de PPs permite subconjuntos de células efetoras diferentes para cooperar, assim, confere a imunocompetência no intestino.
PPs não têm vasos linfáticos aferentes, e devido a este motivo, antígenos transportados para PPs do intestino não estão sendo conduzidos através de vasos linfáticos, em contraste com a maioria dos outros órgãos linfoides. Em vez disso, as células epiteliais especializadas localizadas na FAE, chamadas células M, são responsáveis para a transferência dos antígenos luminal para o PPs5. Posteriormente, os antígenos transportados são captados pelas células dendríticas (DCs) e os fagócitos que estão localizados na região abaixo da FAE6,7subepithelial cúpula (SED). Este processo de classificação de antígeno por DCs em PP é crucial para iniciar a resposta imune adaptativa8 e posterior geração de IgA secretando células9.
Devido o pesado fardo antigênico da flora comensal e material dietético, anfitrião do PPs endogenamente ativado effector T e células B subconjuntos em grande abundância como TFH e IgA+ GC B células10, sugerindo que o PPs representam um site de imune ativo resposta11. Detecção de até 20 – 25% células TFH dentro CD4 total+ T do compartimento de pilha e até 10-15% GC B células dentro das células B totais é possível em PPs colhidos C57BL/6 ratos jovens vivem12. Em contraste com outros tipos de células do ajudante de T (i. e., Th1, Th2, células Th17), células TFH mostram tropismo único em células B folículos principalmente devido à expressão de CXCR5, que promove a orientação de TFH célula ao longo de gradientes CXCL1313. Nas zonas de folículo de células B de PPs, células TFH induzem recombinação de interruptor de classe IgA e somática em células B ativadas, do qual as células produtoras de IgA de alta afinidade diferenciam14. Posteriormente, essas células plasmáticas desegregação migrar para a lâmina própria (LP) e regulam a homeostase imune do intestino,10.
Identificação e caracterização de populações de células TFH e GC B dentro PPs podem permitir aos investigadores investigar a dinâmica da humorais respostas imunes sob condições de estado estacionário, sem a necessidade de modelos de imunização demorada tradicionalmente usado em TFH-GC B célula estudos15,16,17,18. Analisar as células TFH dentro PPs não é tão simples como outros subconjuntos de célula. Desafios técnicos incluem identificar as condições de preparação do tecido ideal, combinação do anticorpo de superfície-marcador, bem como selecionando apropriados controles positivos e negativos. Campos de pesquisa tanto TFH e PP apresentam grande variabilidade em termos de procedimentos experimentais e estão longe de conferir um consenso para estabelecer protocolos padronizados devido a várias razões. Em primeiro lugar, cada subconjunto de célula dentro PPs tende a ser diferencialmente afetaram as condições de preparação de tecido que requer ainda mais modificações na forma de subconjunto específico de célula. Em segundo lugar, há uma discrepância significativa entre os métodos relatados sobre os detalhes da preparação da pilha de PPS. terceiro, o número de estudos comparativos com base em protocolo investigar técnicas de preparação do tecido ideal e condições experimentais para PP e TFH investigação é bastante limitada.
Estudos atuais baseados em protocolo sugeridos para PP célula preparação19,20,21,22 não eram TFH – ou GC orientada em células B. Além disso, algumas condições de preparação do tecido recomendadas para PPs19,20 , tais como digestão baseada em colagenase foram encontradas para afetar negativamente o resultado da identificação de TFH por citometria de fluxo18. Nesta base, nós raciocinou que um protocolo otimizado, padronizado e reproduzível que pode ser usado para estudar a dinâmica de células TFH e GC B no PPs seria valioso para os investigadores a trabalhar sobre este tema. Esta necessidade nos deu o impulso para gerar um protocolo melhorado e actualizado para o isolamento e caracterização de linfócitos PP finamente otimizado para recuperação celular, viabilidade e eficiência para a caracterização de fluxo cytometric de vários T e B subconjuntos de célula. Objetivamos também excluir várias etapas de preparação laboriosa sugeridas em protocolos anteriores, desse modo, reduzindo a manipulações necessárias e o tempo para a preparação de tecidos e células do PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para caracterização de fluxo cytometric das células TFH e GC B. Uma das principais vantagens do nosso protocolo é que ele permite que o isolamento de até 107 (média de 4 – 5 x 106 células) de células PP totais de um único rato (estirpe C57BL/6) sem qualquer processo digestivo. Observamos que o rendimento total da célula foi positivamente correlacionado com o número de PPs e pode ser estimado a partir da seguinte equação simples que é útil par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Laura Strauss e Peter Sage para discussões úteis e apoio com análises de citometria de fluxo.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
