Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma
Summary
Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.
Abstract
Akut miyokard infarktüsü (mı) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen nedenidir. Rejeneratif tıp ana amacı ölü Miyokardiyum MI sonra doldurmak etmektir. Her ne kadar çeşitli stratejiler Miyokardiyum yeniden oluşturmak için kullanılan, kök hücre tedavisi MI kalp ölü Miyokardiyum doldurmak için büyük bir yaklaşım kalır. Kanıt biriken yetişkin kalp ve kalp rejenerasyon endokrin ve/veya parakrin etkileri ikamet kardiyak kök hücreleri (CSCs) varlığını göstermektedir. Ancak, CSC yalıtım ve karakterizasyonu ve farklılaşma miyokard hücreleri, özellikle cardiomyocytes, doğru bir teknik sorun kalır. Bu da çalışmanın, yalıtım, karakterizasyonu ve CSCs farklılaşma yetişkin fare kalp için basit bir yöntem sağladı. Burada, CSCs nerede kalp % 0,2 collagenase II çözüm tarafından sindirilmiş, yalıtım için bir yoğunluk degrade yöntemi açıklanmaktadır. İzole CSCs ayırdetmek için CSCs/kalp işaretleri Sca-1, NKX2-5 ve GATA4 ve pluripotency/stemness işaretleri OCT4, SOX2 ve MicroRNAs ifadesi değerlendirilir. Biz de onları bir kabında kültür ve nükleer silahların yayılmasına karşı işaret Ki-67 ifade değerlendirirken izole CSCs yayılması potansiyelini belirledi. CSCs farklılaşma potansiyeli değerlendirmek için biz yedi – on – gün kültürlü CSCs seçildi. Biz onları cardiomyocyte farklılaşma orta ile yeni bir tabak transfer. Farklılaşma Orta üç günde değişti iken onlar 12 gün boyunca bir hücre kültür kuluçka makinesine inkübe. Cardiomyocyte özel işaretleri farklılaştırılmış CSCs hızlı: Aktinin ve troponin ı. Böylece, stemness ve kardiyak Marker CSCs bu iletişim kuralı ile izole var ve onlar için yayılma ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage bir potansiyele sahip.
Introduction
İskemik kalp hastalığı, akut miyokard infarktüsü (mı), dahil olmak üzere ölüm1dünya çapında önemli bir nedenidir. Ölü Miyokardiyum Yenileyici için kök hücre tedavisi bir mı kalp2,3,4,5kardiyak fonksiyon geliştirmek için önemli bir yaklaşım kalır. Kök hücrelerin farklı türleri ölü Miyokardiyum doldurmak için ve bir MI kalp kardiyak fonksiyon geliştirmek için kullanılmıştır. Embriyonik kök hücre6 ve yetişkin kök hücre genel olarak sınıflandırılabilir. Yetişkin kök hücre, kök hücre türleri, mononükleer hücreler kemik iliği elde edilen7,8, kemik iliği9dan,10, yağ dokusu elde edilen mezenkimal kök hücre gibi kullanılmıştır 11,12ve göbek kordonu13ve CSCs14,15. Kök hücre den endokrin ve/veya parakrin eylemler16,17,18,19,20kardiyak rejenerasyon yükseltebilirsiniz. Ancak, kök hücre tedavisi büyük bir sınırlama çoğalırlar ve/veya doğru belirli kardiyak lineage21,22ayırt kök hücreleri yeterli sayıda almaktır. Otolog ve allojenik kök hücre nakli kök hücre tedavisi9önemli bir sorundur. CSCs onlar yürekten türetilmiştir ve onlar daha kolay kalp soy kalp kök hücreler farklı çünkü kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir yaklaşım olabilir. Böylece, teratoma riskini azaltır. Buna ek olarak, CSCs, endokrin ve parakrin etkileri exosomes ve CSCs türetilmiş miRNAs gibi daha kök hücreler diğer tür daha etkili olabilir. Böylece, CSCs kardiyak rejenerasyon23,24için daha iyi bir seçenek kalır.
CSCs MI kalp kalp kökenlerine nedeniyle kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir aday olmakla birlikte, önemli bir sınırlama CSCs ile daha az verimli yalıtım yöntemini eksikliği nedeniyle verimidir. Başka bir sınırlama CSCs Engelli farklılaşma cardiomyocytes lineage2,25,26,27doğru olabilir. Bu sınırlamaları aşmak için CSC yalıtım, karakterizasyonu ve farklılaşma kardiyak lineage doğru için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek önemlidir. CSCs yok tek kabul edilebilir işaretçisi ve bir belirli hücre yüzeyine marker tabanlı yalıtım CSCs, daha az CSCs verim. Burada, düşük maliyetli ve CSCs artan bir verim içinde sonuç fare kalp CSCs yalıtmak için bir basit degrade Santrifüjü yaklaşım standartlaştırmak. Bu izole CSCs floresans aktif hücre kısa devre tarafından belirli hücre yüzeyine işaretler için seçilebilir. CSCs yalıtım ek olarak, biz CSC kültür, karakterizasyonu ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage için bir protokol sağladı. Böylece, biz izole, karakterize, kültür ve CSCs yetişkin fare kalpler (Şekil 5) ayırt etmek için zarif bir yöntem mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu CSC yalıtım protokol kritik adımları aşağıdaki gibidir. 1) steril bir koşul fareler kalplerin çıkarılması için muhafaza edilmelidir. Kalp ayıklama sırasında herhangi bir kirlenme CSCs. 2 kalitesini bozabilir) kan tamamen birkaç yıkar bütün kalp ve kalp tarafından HBSS çözüm taşlarla yapılır kalp kıyma önce kaldırılmalıdır. 3) kalp parçaları tamamen içine bir tek hücre süspansiyon collagenase çözüm ile lysed gerekir. 4) polysucrose ve sodyum diatrizoate degrade çözüm hücrele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser, parçalar, HL-113281 ve HL116205 Paras Kumar Mishra için Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından desteklenir.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction – From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
