Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale combinata con trascrizione inversa (RT-qPCR) è stato ampiamente utilizzato per misurare il livello di infezioni da virus a RNA. Qui presentiamo un’analisi di RT-qPCR diretta, che non richiede una fase di purificazione di RNA, sviluppato per la quantificazione di parecchi virus RNA, compreso il virus di febbre rompiossa.
Attualmente, la tecnologia di reazione a catena (PCR) in tempo reale della polimerasi è uno strumento indispensabile per la rilevazione e la quantificazione di genomi virali nei laboratori di ricerca, così come per la diagnosi molecolare, a causa della sua sensibilità, specificità, e convenienza. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, l’analisi quantitativa di PCR (qPCR) generalmente utilizzato per rilevare l’infezione del virus ha fatto affidamento sulla purificazione dell’acido nucleico virale prima il passo PCR. In questo studio, l’analisi di fluorescenza-basata trascrizione inversa qPCR (RT-qPCR) si sviluppa attraverso la combinazione di un buffer di elaborazione e un reagente di One-step RT-PCR affinché l’intero processo, dalla raccolta del surnatante cultura di infettati da virus le cellule fino al rilevamento in tempo reale, può essere eseguita senza purificazione di RNA virale. Il protocollo stabilito consente la quantificazione di una concentrazioni di vasta gamma di RNA del virus dengue (DENV) all’interno di 90 min. Inoltre, l’adattabilità del dosaggio RT-qPCR diretto alla valutazione di un agente antivirale è dimostrata da un esperimento in vitro utilizzando un inibitore DENV precedentemente segnalato, l’acido micofenolico (MPA). Inoltre, altri virus RNA, inclusi virus della febbre gialla (YFV), virus di Chikungunya (CHIKV) e il virus del morbillo (MeV), può essere quantificata da RT-qPCR diretto con lo stesso protocollo. Pertanto, l’analisi di RT-qPCR diretto descritto in questo rapporto è utile per monitorare la replica del RNA del virus in modo rapido e semplice, che sarà ulteriormente sviluppato in una piattaforma promettente per uno studio di high throughput screening e la diagnosi clinica.
Il genere Flavivirus della famiglia Flaviviridae comprende più di 70 avvolto, virus a RNA positivo filamento che vengono trasmessi da zanzare e zecche. D’importanza, infezione di flavivirus negli esseri umani spesso conduce alla malattia clinica severa, come febbre ed encefalite emorragica1. Infatti, una recente epidemia del virus di Zika (ZIKV), un flavivirus, esplosivo si è diffuso in tutta l’America ed è stata indicata per essere associata con le complicazioni neurologiche, compreso microcefalia2,3. Flavivirus, pertanto, avere significativo impatto clinico ed economico sulla società moderna.
Un flavivirus importante è virus dengue (DENV), un virus zanzara ampiamente distribuito nelle zone tropicali e subtropicali del mondo. DENV è trasmesso dalle zanzare Aedes , tra cui Aedes albopictus e Aedes aegypti, conseguente la diffusione globale di febbre rompiossa focolai4. Attualmente, l’organizzazione mondiale della sanità (OMS) classifica la malattia dengue come tre categorie: dengue senza segni premonitori, dengue con segni premonitori e grave febbre rompiossa4. Anche se l’infezione primaria con uno dei quattro sierotipi di DENV (DENV-1 a -4) è spesso asintomatica o auto-di limitazione, gli studi epidemiologici hanno dimostrato che l’infezione secondaria di sierotipi diversi aumenta il rischio di forme più gravi di febbre rompiossa. Vale la pena notare che anticorpo-dipendente il potenziamento di infezione DENV causata da non – o subneutralizing anticorpi prodotti durante l’infezione primaria è stata proposta come un meccanismo potenziale di dengue grave che si è verificato come l’infezione secondaria. Tuttavia, nessun farmaco antivirale specifico è disponibile per DENV infezione5.
Per lo sviluppo di agenti antivirali contro DENV, routine e robusti saggi, che sono favorevoli a un ambiente di alto-rendimento, sono essenziali per la rilevazione quantitativamente la replicazione del virus. Convenzionalmente, i saggi biologici (ad es., analisi della piastra) per la quantificazione di virus infettivi e saggi immunologici (ad es., analisi enzima-collegata dell’immunosorbente [ELISA]) per la rilevazione degli antigeni virali sono stati utilizzati per monitorare DENV replica in vitro e in vivo6,7. Tuttavia, queste analisi sono spesso laboriose e richiedono diversi giorni per compire, che ostacola la gestione di un gran numero di campioni. A questo proposito, RT-qPCR è un test affidabile per la rilevazione dell’infezione di DENV: è specifico, sensibile e relativamente veloce7. Inoltre, la tecnica di RT-qPCR ha più vantaggi in un formato ad alta velocità. Tuttavia, la procedura tipica di RT-PCR per il virus del RNA richiede il recupero di acidi nucleici virali da campioni raccolti. Anche se vari metodi di estrazione possono essere impiegate per RT-qPCR, più passaggi ancora sono necessari per ottenere RNA virale purificato. Inoltre, analisi di RT-qPCR di solito richiedono costosi filare colonne o pericolosi solventi organici, così da rendere il processo di preparazione più ingombrante. Poiché evitare manovre errate e/o cross-contaminazione tra i campioni è un fattore critico per il successo quantificazione dei genomi virali, un metodo meno laborioso e che richiede tempo è comodo, soprattutto se la RT-qPCR deve essere applicato a formato ad alta velocità.
Qui, segnaliamo una semplice procedura di RT-qPCR per misurare DENV RNA in un supernatante di coltura di cellule infette che non implichi la purificazione di RNA virale. Questo protocollo RT-qPCR ottimizzato è composto da due fasi: i) l’incubazione di un supernatante di coltura cellulare DENV-infettati con un buffer di elaborazione e ii) One-step RT-qPCR su uno strumento PCR in tempo reale. Di conseguenza, DENV RNA in un supernatante di coltura può essere rilevato all’interno di 90 min (Figura 1). Inoltre descriviamo l’applicazione della RT-qPCR diretti ad altre infezioni di virus a RNA.
Oggi, la rilevazione dell’acido nucleico virale mediante PCR in tempo reale basati su fluorescente sta diventando un gold standard per la diagnosi molecolare di virus patogeni umani, a causa della sua sensibilità e rapidità7. Ciò è particolarmente importante per la conferma di infezione da virus nella fase precoce di malattie infettive acute come febbre di febbre rompiossa17. Inoltre, nel campo della ricerca di base DNEV, analisi di RT-qPCR è uno strumento indispensabile per la replicazione del virus in cultura, in vitro , che condurrà ad una comprensione della biologia replica di DENV e la scoperta degli inibitori antivirali di monitoraggio. In questo studio, l’analisi di PCR in tempo reale basati su fluorescente più ulteriormente è stato sviluppato da una combinazione di un buffer di elaborazione e un reagente di One-step RT-PCR affinché DENV RNA nel supernatante di coltura delle cellule infettate è stato in grado di essere quantificata per RT-qPCR senza purificazione il genoma virale del RNA. Rispetto alle analisi di routine per rilevare la replicazione del virus, come saggio della placca, ELISA o convenzionale RT-qPCR impiegando RNA purificazione6,7, un protocollo semplificato del dosaggio RT-qPCR ha provocato una notevole riduzione del tempo e passaggi necessari per quantificare il RNA DENV. Questo è anche una caratteristica importante che ha dei vantaggi riducendo al minimo la contaminazione e la perdita di materiale genetico. Tuttavia, si deve osservare che l’uso di una cappa pulita è essenziale nella messa a punto di IVT (punto 2.1) e reazioni di RT-qPCR (passaggi 4.1 – 4.4) per evitare la contaminazione di prodotti correlati amplicone o RNasi. È anche fondamentale per gestire il surnatante, compresi virus contagioso, all’interno di una cappa di biosicurezza (punto 3.3) per ridurre il rischio di infezione da laboratorio di cultura.
Un altro significato del dosaggio RT-qPCR diretto è che una vasta gamma di copie di RNA virale possa essere analizzata allo stesso tempo senza diluizione o concentrazione del campione. Quando è stato utilizzato diluito serialmente DENV 3′ UTR RNA standard, il protocollo RT-qPCR diretto prodotto una curva lineare standard sopra sette ordini di grandezza e il limite di quantificazione inferiore era 500 copie di RNA (Figura 2). Per la rilevazione di DENV nel supernatante di coltura delle cellule infettate, 8 x 103 a 8 x 10-2 virus PFU in un 10 μL RT-qPCR erano entro lo standard gamma di DENV 3′ UTR RNA ed il limite inferiore di rilevamento (8 x 10-2 PFU) è stato calcolato per contenere 11 , 400 ± 7.077 copie di RNA (Figura 3B). Di nota, come riportato in diversi flavivirus studi18,19,20, il più grande rapporto di copie di RNA virale a titolo infettive del virus (cioè, PFU) in campioni di DENV inoltre è stato osservato in questo studio. Questa sopravvalutazione è presupposto per essere in gran parte dovuto la presenza di difettoso (cioè, non-infettiva) virus o il RNA virale libero liberati dalle cellule infette e morte. Anche se il rapporto di RNA copie: PFU ottenuti in questo studio (1.1 x 105 a 1,3 x 105 RNA copie/PFU) era in contrasto con i dati riportati in precedenza (gamma di rapporti da 1 a 3 log)21,20, questo può essere attribuito per la differenza di ceppi di virus, cellule o condizioni di coltura impiegate. Un’altra spiegazione probabile per la discrepanza è che, dal momento che nessun processo di purificazione di RNA è stato coinvolto nell’analisi della RT-qPCR diretto qui descritto, più DENV RNA nel surnatante cultura potrebbe essere rilevata dall’analisi di PCR in tempo reale senza la perdita di virale materiali genetici.
La semplicità del diretto RT-qPCR aumenta la capacità di gestire un elevato numero di campioni in multi-ben formati, ad esempio una piastra a 96 pozzetti. Pertanto, questa proprietà vi assisterà la futura applicazione del test RT-qPCR diretto ad uno studio di screening ad alta resa per la scoperta di farmaci anti-DENV. Infatti, in questo rapporto, applicazione del test RT-qPCR diretto per la convalida di un inibitore anti-DENV, MPA, è stato esaminato, e il risultato ha mostrato che un valore di50 IC di MPA ottenuto dall’analisi di RT-qPCR diretto (Figura 4) era paragonabile a quella riferito negli studi precedenti usando placca dosaggio12,13. Questo dimostra che RT-qPCR diretto è un test utile per valutare in modo appropriato l’effetto inibitorio degli agenti antivirali e può essere adottata in una droga Studio di screening in futuro.
In questo studio, sono stati tentativi di applicare la RT-qPCR diretto per la rilevazione di altri virus RNA. Come mostrato nella Figura 5, quando 10 volte diluizioni di tre altri virus RNA (YFV, CHIKV e MeV) classificate in generi diversi (Flaviviridae, Togaviridaee Paramyxoviridae, rispettivamente) sono stati esaminati usando precedentemente segnalati primer e fluorogenic sonde specifiche per le rispettive sequenze RNA virali. Buone correlazioni tra infettivi titoli e valori di Ct sono state ottenute dall’analisi di RT-qPCR dirette e le correlazioni erano lineari 4-6 ordini di grandezza. Questo suggerisce che il protocollo RT-qPCR diretto è adattabile a vari tipi di virus del RNA semplicemente cambiando i virus-specifici primer e sonde fluorogeniche.
Tuttavia, la sensibilità di rilevamento varia fra i virus testati in questo studio (Figura 5). Una modifica del protocollo che può migliorare la rilevazione del RNA del virus di destinazione dovrebbe essere quello di utilizzare un nuovo set di sequenze primer/sonda. Inoltre, un passo fondamentale per il successo diretto RT-qPCR dosaggio è pensato per essere il rilascio efficiente del genoma virale durante l’esempio elaborazione di passo (passaggi 3.1-3.4). Questo sarebbe di particolare importanza per la rilevazione quantitativa di virus stabile come un virus non capsulati. Anche se come un esperimento preliminare, Coxsackievirus B3 (CVB3), un virus a RNA non capsulati appartenendo a Picornaviridae, è stato sottoposto a test RT-qPCR diretto utilizzando primer CVB3 specifici descritti in precedenza e sonda fluorescente22, un amplicon positivo segnale potrebbe non essere rilevato anche con uno stock di virus di alto-titolo (1 x 105 PFU/mL). Questo è considerato essere in gran parte attribuita all’alta integrità fisica del virus non capsulati. Finora, alcune analisi di RT-PCR che non richiedono la purificazione dell’acido nucleico sono state sviluppate per rilevare diversi virus del RNA, che impiegano protocolli diversi nella versione RNA passo23,24,25, 26. così, l’uso dei trattamenti alternativi (o supplementari), ad esempio un’incubazione di un campione di virus ad alta temperatura, potenzialmente aumenta la sensibilità di rilevazione.
In sintesi, il protocollo RT-qPCR diretto sviluppato in questo studio era un metodo semplice e rapido ma affidabile per la quantificazione di RNA virale in un supernatante di coltura delle cellule infettate. L’analisi di RT-qPCR diretto, a causa di questa semplicità, è in grado di elaborare un numero di campioni in tempi brevi, che tiene la promessa per l’analisi ad alta velocità di replicazione del virus. Inoltre, l’applicazione del protocollo RT-qPCR diretto ad altri virus RNA inoltre è stata dimostrata. Questo approccio dovrebbe, pertanto, essere uno strumento utile per il monitoraggio in modo efficiente le infezioni di virus a RNA in un ambiente di laboratorio di ricerca e, possibilmente, in diagnosi cliniche.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore) per DENV-2 isolare EDEN2 3295 e Shunro Imura (Kobe Quarantine Station, Giappone) per il YFV sforzo vaccine 17D. Gli autori sono anche grati ai membri del dipartimento di microbiologia e controllo delle infezioni per la loro assistenza. Questo lavoro è supportato da MEXT KAKENHI Grant numero JP16737900.
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | > 600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |