Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.
Op dit moment real-time polymerase kettingreactie (PCR) technologie is een onmisbaar hulpmiddel voor de detectie en kwantificering van het virale genoom in onderzoekslaboratoria, alsmede voor moleculaire diagnostiek, vanwege de gevoeligheid, specificiteit, en gemak. Echter in de meeste gevallen de kwantitatieve bepaling van de PCR (qPCR) in het algemeen gebruikt voor speurder virusinfectie heeft vertrouwd op de zuivering van virale nucleïnezuur voorafgaand aan de PCR-stap. In deze studie, is de omgekeerde transcriptie fluorescentie gebaseerde qPCR (RT-qPCR) test ontwikkeld door de combinatie van een verwerking buffer en een one-step RT-PCR reagens zodat het hele proces, van de oogst van het supernatans dat cultuur van virus-geïnfecteerde cellen tot real-time detectie, kunnen worden uitgevoerd zonder virale RNA zuivering. De gangbaar protocol kan de kwantificering van een breed scala van RNA concentraties van dengue virus (DENV) binnen 90 min. Daarnaast is het aanpassingsvermogen van de directe bepaling van de RT-qPCR aan de evaluatie van een antivirale agent aangetoond door een in vitro -experiment met behulp van een eerder gemelde DENV-remmer, mycophenolic zuur (MPA). Andere RNA-virussen, inclusief gele koorts virus (YFV), Chikungunya-virus (CHIKV) en mazelenvirus (MeV), kunnen bovendien worden gekwantificeerd door directe RT-qPCR met hetzelfde protocol. Dus, de directe RT-qPCR bepaling in dit verslag beschreven is handig voor het controleren van de replicatie van RNA-virus op een eenvoudige en snelle wijze, die verder zal worden ontwikkeld tot een veelbelovende platform voor high-throughput screening onderzoek en klinische diagnose.
Het geslacht Flavivirus van de Flavivirus -familie omvat meer dan 70 gehuld, positief-stranded RNA-virussen die worden overgebracht door muggen en teken. Bovenal leidt flavivirus infectie bij de mens vaak tot ernstige klinische ziekte, zoals hemorragische koorts en encefalitis1. Inderdaad, een recente uitbraak van het Zika-virus (ZIKV), een flavivirus, explosief heeft verspreid over Amerika en is aangetoond dat gepaard gaan met neurologische complicaties, met inbegrip van microcefalie2,3. Flavivirussen, daarom hebben significante klinische en economische invloed op de moderne samenleving.
Een belangrijke flavivirus is dengue virus (DENV), een muggen overgebrachte virus verspreid in de tropische en subtropische gebieden van de wereld. DENV wordt overgedragen door Aedes -muggen, met inbegrip van Aedes albopictus en Aedes aegypti, resulterend in de wereldwijde verspreiding van dengue uitbraken4. Op dit moment de World Health Organization (WHO) dengue ziekte classificeert als drie categorieën: dengue zonder waarschuwingsborden, dengue met waarschuwingsborden en ernstige dengue4. Hoewel de primaire infectie met één van de vier serotypes van DENV (DENV-1-4) is vaak asymptomatisch of zelfbeperkende, hebben epidemiologische studies aangetoond dat de secundaire infectie van verschillende serotypes het risico van meer ernstige vormen van dengue verhoogt. Het is vermeldenswaard dat antilichaam-afhankelijke versterking van DENV infectie veroorzaakt door het niet – of subneutralizing van antilichamen geproduceerd tijdens de primaire infectie is voorgesteld als een potentiële mechanisme van ernstige dengue die zich hebben voorgedaan als het secundaire infectie. Echter is geen specifieke antivirale drug beschikbaar voor DENV infectie5.
Voor de ontwikkeling van antivirale middelen tegen DENV zijn routine en robuuste vitrotests, die zich lenen voor een high-throughput instelling, van essentieel belang voor het opsporen van virus replicatie kwantitatief. Conventioneel, zijn biologische testen (bijvoorbeeld, plaque assay) voor het kwantificeren van besmettelijke virussen en immunologische testen (bijvoorbeeld, enzym-verbonden immunosorbent analyse [ELISA]) voor het opsporen van virale antigenen gebruikt voor het controleren van DENV replicatie in vitro en in vivo6,7. Echter deze testen vaak moeizame en vereisen meerdere dagen te bereiken, die de behandeling van grote aantallen monsters die monsters belemmert. In dit verband RT-qPCR is een betrouwbare assay voor het opsporen van DENV-infectie: het is specifieke, gevoelige en relatief snelle7. Daarnaast heeft de RT-qPCR techniek meer voordelen in een high-throughput formaat. Niettemin, de typische procedure van rechts-PCR voor RNA virussen vraagt de terugwinning van virale nucleic zuren uit verzamelde monsters. Hoewel verschillende extractiemethoden kunnen worden ingezet voor RT-qPCR, zijn nog steeds meerdere stappen nodig te verkrijgen van gezuiverde virale RNA. RT-qPCR testen vereisen ook, meestal dure spin kolommen of gevaarlijke organische oplosmiddelen, waardoor het voorbereidingsproces omslachtiger. Aangezien het vermijden van verkeerde behandeling en/of kruisbesmetting tussen de monsters een kritische factor voor de succesvolle kwantificering van het virale genoom is, heeft een minder moeizame en tijdrovende methode de voorkeur, met name als de RT-qPCR moet worden toegepast op High-throughput formaat.
Wij rapporteren hier een eenvoudige procedure van de RT-qPCR voor het meten van DENV RNA in een cultuur supernatant van geïnfecteerde cellen die geen virale RNA zuivering. Dit geoptimaliseerde RT-qPCR-protocol bestaat uit twee stappen: i) de incubatie van een supernatant van cultuur van de cel DENV-besmet met een buffer van de verwerking, en ii) one-step RT-qPCR op een real-time PCR-instrument. Dienovereenkomstig, DENV RNA in een cultuur supernatant kan worden gedetecteerd binnen 90 min (Figuur 1). Ook beschrijven we de toepassing van de directe RT-qPCR op andere RNA-virus-infecties.
Vandaag, wordt virale nucleïnezuur detectie door fluorescentie gebaseerde PCR in real time steeds een gouden standaard voor de moleculaire diagnose van pathogene menselijke virussen, toe te schrijven aan zijn gevoeligheid en snelheid7. Dit is vooral belangrijk voor het bevestigen van de virusbesmetting in de vroege fase van acute besmettelijke ziekten zoals dengue koorts17. Ook op het gebied van fundamenteel DNEV onderzoek is RT-qPCR assay een onmisbaar instrument voor het controleren van de replicatie van het virus in in vitro cultuur, die tot een goed begrip van de biologie van de replicatie van DENV en de ontdekking van antivirale remmers leiden zal. In deze studie werd de TL gebaseerde real-time PCR-test verder ontwikkeld door een combinatie van een verwerking buffer en een one-step RT-PCR reagens zodat DENV RNA in het supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen kon worden gekwantificeerd door RT-qPCR zonder zuiveren het virale RNA genoom. In vergelijking met routinematige testen voor speurder virus replicatie, zoals plaque-test, ELISA of conventionele RT-qPCR dienst nemen RNA zuivering6,7, een vereenvoudigde protocol van de RT-qPCR bepaling resulteerde in een grote vermindering van de tijd en Stapsgewijze instructies voor het kwantificeren van DENV-RNA. Dit is ook een belangrijk kenmerk dat voordelen heeft bij het minimaliseren van de besmetting en het verlies van genetische materialen. Toch moet opgemerkt worden dat het gebruik van een schone kap essentieel in de opzet van de IVT (stap 2.1) en RT-qPCR (stappen 4.1-4.4) Reacties is te vermijden de kruisbesmetting van amplicon-gerelateerde producten of RNase. Het is ook van cruciaal belang om de cultuur supernatant, met inbegrip van besmettelijke virus, binnen een kabinet bioveiligheid (stap 3.3) om een risico van laboratorium infectie te verminderen.
Een andere betekenis van de directe bepaling van de RT-qPCR is dat een breed scala van virale RNA exemplaren tegelijk zonder verdunning of concentratie van het monster kan worden geanalyseerd. Wanneer een serieel verdunde DENV 3′ UTR RNA standaard werd gebruikt, het directe RT-qPCR-protocol geproduceerd een standaard lineaire curve over zeven ordes van grootte, en de ondergrens van de kwantificering was 500 exemplaren van de RNA (Figuur 2). Voor de detectie van DENV in het supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen, 8 x 10,3 tot en met 8 x 10-2 PFU virussen in een 10 μL RT-qPCR waren binnen het bereik van DENV 3′ UTR RNA standaard, en de onderste detectiegrens (8 x 10-2 van PFU) werd berekend bevat 11 , 400 ± 7,077 RNA exemplaren (figuur 3B). Van de nota, zoals gemeld in verschillende flavivirus studies18,19,20, werd de grotere verhouding van virale RNA kopieën te virus besmettelijk titer (d.w.z., PFU) in DENV monsters ook waargenomen in deze studie. Deze overschatting wordt ervan uitgegaan dat grotendeels te wijten aan de aanwezigheid van defect (dat wil zeggen, niet-infectieuze) virussen of gratis virale RNA vrijgelaten uit besmette en dode cellen. Hoewel de verhouding van RNA kopieën: PFU in deze studie verkregen (1.1 x 105 tot en met 1.3 x 105 RNA kopieën/PFU) was onverenigbaar is met de gegevens die eerder weergegeven (ratio’s variëren van 1 tot 3 log)21,20, dit kan worden toegeschreven aan het verschil in virusstammen, cellen en kweekomstandigheden werkzaam. Een andere waarschijnlijke verklaring voor de discrepantie is dat, aangezien geen RNA zuiveringsproces bij de directe RT-qPCR bepaling hierin beschreven betrokken was, meer DENV RNA in het supernatant van cultuur kon worden opgespoord door middel van real-time PCR analyse zonder verlies van virale genetische materialen.
De eenvoud van de directe RT-qPCR verbetert de mogelijkheid om een groot aantal monsters in multi goed formaten, zoals een 96-wells-plaat. Daarom is deze eigenschap zal helpen de toekomstige toepassing van de directe bepaling van de RT-qPCR op een studie van de high-throughput screening voor de ontdekking van anti-DENV drugs. Inderdaad, in dit verslag, toepassing van de directe bepaling van de RT-qPCR voor de validatie van een anti-DENV-remmer, MPA, werd onderzocht, en het resultaat toonde aan dat een IC50 waarde van MPA verkregen door de directe bepaling van de RT-qPCR (Figuur 4) vergelijkbaar is met die gerapporteerd in eerdere studies met behulp van de12,13van de bepaling van de plaque. Dit toont aan dat directe RT-qPCR een nuttig assay is voor het remmende effect van antivirale middelen op de juiste manier te evalueren en in een drug screening van studie in de toekomst kan worden aangenomen.
In deze studie werden pogingen gedaan om gelden de directe RT-qPCR voor de opsporing van andere RNA-virussen. Zoals aangegeven in Figuur 5, wanneer 10-fold verdunningen van drie andere RNA virussen (YFV, CHIKV en MeV) ingedeeld in verschillende geslachten (Flavivirus, Togaviridaeen Paramyxoviridae, respectievelijk) werden onderzocht met behulp van eerder sondes gerapporteerde primers en fluorogenic specifiek voor de respectieve virale RNA opeenvolgingen. Goede correlaties tussen besmettelijke titers en Ct-waarden werden verkregen door rechtstreekse RT-qPCR testen en de correlaties werden 4-6 lineaire ordes van grootte. Dit suggereert dat het directe RT-qPCR-protocol aanpasbaar aan verschillende soorten van RNA-virussen is door simpelweg het veranderen van de virus-specifieke primers en fluorogenic sondes.
Niettemin, de gevoeligheid van detectie gevarieerd onder de virussen getest in deze studie (Figuur 5). Een wijziging van het protocol dat de detectie van doel virus RNA kan verbeteren moet een nieuwe set primer/sonde sequenties gebruikt. Daarnaast is een belangrijke stap voor de succesvolle directe RT-qPCR assay wordt beschouwd als de efficiënte introductie van het virale genoom tijdens het monster verwerking stap (stap 3.1-3.4). Dit zou van bijzonder belang voor de kwantitatieve detectie van stabiele virussen zoals een virus niet-gehuld. Hoewel het als een apart experiment, Coxsackievirus B3 (CVB3), een niet-gehuld-RNA-virus behorend tot Picornaviridae, werd onderworpen aan de directe bepaling van de RT-qPCR met behulp van de eerder beschreven CVB3-specifieke primers en fluorescente sonde22, een positieve signaal van de amplicon kon niet worden herkend zelfs met een hoge titer (1 x 105 van PFU/mL) virus voorraad. Dit wordt beschouwd als grotendeels worden toegeschreven aan de hoge fysieke integriteit van het virus niet-gehuld. Tot nu toe enkele RT-PCR-tests dat vereisen geen zuivering van nucleic zuur zijn ontwikkeld om te detecteren van verschillende RNA-virussen, die verschillende protocollen in de RNA-release in dienst stap23,24,25, 26. dus, gebruik van de alternatieve (of extra) behandelingen, zoals een incubatie van een virus steekproef bij een hoge temperatuur, potentieel verhoogt de gevoeligheid van detectie.
Kortom was de directe RT-qPCR-protocol dat is ontwikkeld in deze studie een eenvoudige en snelle maar betrouwbare methode voor het kwantificeren van de virale RNA in een cultuur supernatant van geïnfecteerde cellen. Vanwege deze eenvoud, konden de directe bepaling van de RT-qPCR een aantal monsters in een korte tijd, die belofte voor de analyse van de high-throughput van virus replicatie houdt verwerken. Bovendien was de toepassing van het directe RT-qPCR-protocol voor andere RNA virussen ook aangetoond. Deze aanpak moet daarom een nuttig instrument voor efficiënt toezicht op de RNA-virus-infecties in een instelling van de laboratorium onderzoek en eventueel in de klinische diagnose.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Subhash G. Vasudevan (Onderzoekschool Medical Duke-NUS, Singapore) voor de DENV-2 isoleren EDEN2 3295 en Shunro Imura (Kobe quarantaine Station, Japan) voor de YFV 17D vaccinstam. De auteurs zijn ook dankbaar voor de leden van het departement microbiologie en infectiecontrole voor hun hulp. Dit werk wordt ondersteund door MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | > 600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |