תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן
Summary
התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.
Abstract
סרטן שלפוחית השתן היא בעיה בריאותית משמעותית. ההערכה היא כי יותר מ 16,000 אנשים ימותו השנה בארצות הברית מסרטן שלפוחית השתן. בעוד 75% ממקרי סרטן שלפוחית השתן הם לא פולשנית, לא סביר גרורות, כ-25% ההתקדמות דוגמת גידול פולשני. עד חצי של החולים עם סרטן פולשני יפתחו relapse גרורתי קטלני. לפיכך, הבנת המנגנון של התקדמות פולשני בסרטן שלפוחית השתן היא קריטית לחזות תוצאות המטופל וכדי למנוע גרורות קטלניות. במאמר זה, נציג מודל הפלישה סרטן תלת מימדי המאפשר שילוב של תאים סרטניים ורכיבים סטרומה לחקות ויוו מצבים המתרחשים microenvironment הגידול שלפוחית השתן. מודל זה מספק הזדמנות לבחון את תהליך פולשני בזמן אמת באמצעות הדמיה בצילום מואץ, תחקור מסלולים מולקולריים המעורבים באמצעות קונאפוקלית immunofluorescent תרכובות הדמיה ומסך עם פוטנציאל הפלישה בלוק. בעוד פרוטוקול זה מתמקד סרטן שלפוחית השתן, סביר להניח כי ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לבחון את הפלישה, תנועתיות בסוגי סרטן אחרים גם.
Introduction
הפלישה הוא שלב קריטי בהתקדמות סרטן, אשר נדרש עבור גרורות, והיא קשורה עם הישרדות נמוכה יותר, פרוגנוזה גרועה אצל חולים. ב סרטן שלפוחית השתן אנושי, הגידול הנפוץ ביותר בדרכי השתן הגורמת כ 165,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם, שלב סרטן, הטיפול והפרוגנוזה אינם קשורים ישירות נוכחות או היעדרות של הפלישה1. כ- 75% מהמקרים של סרטן שלפוחית השתן מנוהלים שאינם שרירים פולשנית ואינם עם כריתה מקומית. לעומת זאת, סרטן פולשני שריר שלפוחית השתן (כ-25% מכלל המקרים) הם גידולים אגרסיביים עם שיעור גרורתי גבוה ומטופלים עם2,טיפול אגרסיבי multimodality3. לכן, הבנה מסלולים מולקולריים המפעילות הפלישה הוא חיוני כדי לאפיין טוב יותר את הסיכון של התקדמות פולשנית וכדי לפתח התערבויות טיפוליות אשר יכול למנוע התקדמות פולשני.
גידול פולשני התקדמות מתרחשת בסביבה מורכבת תלת-ממדיים (3-D), ושכוללת מגע תא הגידול עם תאים סרטניים אחרים, משתית, קרום המרתף של סוגים אחרים של תאים כולל תאים חיסוניים, fibroblasts, תאי שריר ואת כלי הדם תאי אנדותל. תמיכה חדיר (למשל, Transwell) מערכות assay מועסקים בדרך כלל quantitate סרטן התא הפלישה4, אבל מערכות אלה מוגבלים כי הם אינם מאפשרים פיקוח מיקרוסקופיים של תהליך הפלישה בזמן אמת, אחזור דוגמאות נוספות מכתים וניתוח המולקולרי של הוא מאתגר. התפתחות מערכת ספרואיד גידול שלפוחית השתן תלת-ממדי ללמוד הפלישה רצוי כי זה מאפשר שילוב של רכיבים המוגדרים microenvironmental עם הנוחות של מערכות במבחנה .
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת לחקור את התהליכים פולשנית של תאים סרטניים אנושיים שלפוחית השתן באמצעות assay הפלישה ספרואיד תלת-ממדי הופכים ג’ל מבוססי קולגן מטריצות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאפשר חוקרים כדי לפקח על תנועתיות תא ו הפלישה ב בזמן אמת (איור 1א’). מערכת זו הוא תכליתי, יכול להיות שונה כדי לחקור את הגדרות סטרומה/גידול שונות. זה ניתן לשלב רוב שורות תאים של סרטן שלפוחית השתן או גידולים בשלפוחית השתן העיקרי, סטרומה תאים נוספים כגון סרטן הקשורים fibroblasts ותאים חיסוניים5,6,7. פרוטוקול זה מתאר מטריצה מורכבת של קולגן מסוג 1, אך יכול להיות שונה כדי לשלב את מולקולות אחרות כגון fibronectin, laminin או לחלבונים קולגן אחרים. יכול להיות מלווה תהליכים פולשניים במשך 72 h או יותר בהתאם היכולת של מיקרוסקופ, מערכת המשמשת. קיבעון, immunofluorescence מכתים של הגידול מוטבע בתוך המטריקס תלת-ממדי לפני, במהלך, ואחרי הפלישה מאפשר חקירת upregulated חלבונים בתאים פולשני, ובכך לספק מידע חיוני זה בדרך כלל נעדר או קשה לאסוף באמצעות דגמים תלת-ממדיים תרבות אחרים. גם יכול להיות מנוצל מערכת זו תרכובות מסך אשר לחסום את הפלישה, ניסחו איתות המסלולים מושפע תרכובות כאלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר מודל תלת-ממדי הגידול ספרואיד המאפשר תצפית בזמן אמת של פלישה של סרטן שלפוחית השתן אשר הוא קריטי עבור התקדמות סרטן, גרורות. מערכת זו היא נוטה שילוב של רכיבים סטרומה וסלולריות שונים כדי לאפשר חוקרים כדי לסכם טוב יותר microenvironment את רקמת שם מתקיים הפלישה סרטן שלפוחית השתן. Spheroids סרטן שלפו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות המעבדה של ד ר הווארד קרופורד (אוניברסיטת מישיגן) עבור תמיכה טכנית מתן וחומרים במחקר זה ציוד אלן קילר לקבלת תמיכה טכנית.
עבודה זו מומן על ידי מענקים מן האוניברסיטה של מישיגן רוגל סרטן מרכז הליבה גרנט CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (פיפ), ניתן YIA (פיפ), CA17483601A1 R01 NIH (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. . The Society. , (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
