3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs
Summary
Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.
Abstract
Blasenkrebs ist eine erhebliche gesundheitliche Problem. Es wird geschätzt, dass mehr als 16.000 Menschen in diesem Jahr in den Vereinigten Staaten von Blasenkrebs sterben. Während 75 % der Krebserkrankungen der Blase sind nicht-invasiv und unwahrscheinlich zu metastasieren, Fortschritte machen etwa 25 % ein invasives Wachstum Muster. Bis zur Hälfte der Patienten mit invasiven Krebsarten entwickeln tödliche Metastasen Rückfall. Daher ist es entscheidend, Vorhersagen, Behandlungsergebnisse zu vermeiden tödliche Metastasen, Verständnis des Mechanismus der invasiven Progression bei Blasenkrebs. In diesem Artikel präsentieren wir ein dreidimensionales Krebs Invasion Modell, das ermöglicht die Einbindung von Tumorzellen und Stromazellen Komponenten, in Vivo Bedingungen, die in der Blase Tumor Mikroumgebung zu imitieren. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, den invasiven Prozess mit Zeitraffer Bildgebung in Echtzeit beobachten, befragen die molekulare Bahnen beteiligt mit konfokale immunofluorescent Bildgebung und Bildschirm-Verbindungen mit dem Potenzial, Block-Invasion. Während dieses Protokoll auf Blasenkrebs konzentriert, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Methoden zur Untersuchung von Invasion und Motilität in sowie andere Tumorarten eingesetzt werden könnte.
Introduction
Invasion ist ein wichtiger Schritt bei Tumorprogression, die Metastasen gefordert, und ist verbunden mit niedrigeren überleben und schlechter Prognose bei Patienten. In der menschlichen Blasenkrebs, am häufigsten Malignome der Harnwege verursacht etwa 165.000 Todesfälle pro Jahr weltweit, krebsstadium, Behandlung und Prognose direkt das Vorhandensein oder Fehlen von Invasion1beziehen sich auf. Rund 75 % der Fälle von Blasenkrebs werden nicht-Muskel invasive und sind mit lokalen Resektion verwaltet. Im Gegensatz dazu Muskel-invasive Blase Krebs (ca. 25 % aller Fälle) sind aggressive Tumoren mit hoher metastasierendem und werden mit aggressiven Multimodalität Therapie2,3behandelt. Daher ist es wichtig, um das Risiko der invasiven Progression besser charakterisieren und therapeutische Interventionen zu entwickeln, die invasive Fortschreiten verhindern können, Verständnis der molekularen Signalwege, die Invasion auslösen.
Invasive Tumorprogression tritt in einem komplexen Umfeld für dreidimensionale (3D) und beinhaltet Tumor Zelle Interaktion mit anderen Tumorzellen, Stroma, Basalmembran und andere Arten von Zellen wie Immunzellen, Fibroblasten, Muskelzellen und vaskuläre Endothelzellen. Durchlässige Unterstützung (z.B.Transwell) Assay-Systeme werden häufig eingesetzt, um Krebs Zelle Invasion4, aber diese Systeme quantitate sind begrenzt, weil sie nicht erlauben, mikroskopische Überwachung des Invasion in Echtzeit und die Entnahme von Proben für weitere Färbung und molekulare Analyse ist eine Herausforderung. Entwicklung eines 3-d-Blase Tumor Sphäroid Invasion zu studieren ist wünschenswert, weil dadurch die Aufnahme von definierten microenvironmental Komponenten mit dem Komfort einer in-vitro- Systeme.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein System, um die invasiven Prozesse der menschlichen Blase Krebszellen mit einem 3-d-Sphäroid Invasion Assay mit Kollagen-basierten Gel Matrizen und konfokalen Mikroskopie damit Ermittler Zelle Motilität überwachen zu verhören und Invasion in Echtzeit (Abb. 1A). Dieses System ist vielseitig und kann geändert werden, um verschiedene Stromatumoren Tumor/Einstellungen zu befragen. Es kann die meisten Blase Krebs-Zell-Linien oder primäre Blase Tumoren und zusätzliche Stromazellen Zellen enthalten, wie z. B. Krebs Fibroblasten und Immunzellen5,6,7verbunden. Dieses Protokoll beschreibt eine Matrix, bestehend aus Kollagen Typ 1, aber kann geändert werden, um andere Moleküle wie FIBRONEKTIN, Laminin oder andere Proteine Kollagen zu integrieren. Invasive Verfahren können für 72 h oder länger je nach der Fähigkeit, das Mikroskop und das verwendete verfolgt werden. Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung des Tumors in der 3-d-Matrix eingebettet, vor, während und nach dem Einmarsch ermöglicht das Verhör von Proteinen hochreguliert in invasive Zellen, wodurch wichtige Informationen, die normalerweise nicht vorhanden oder schwierig zu sammeln Verwendung von anderen 3-d-Kultur-Modellen. Dieses System kann auch genutzt werden, zu Bildschirm-Verbindungen, die Invasion zu blockieren und Signalwege, die solche Verbindungen betroffen abzugrenzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine 3-d-Tumor-Sphäroid-Modell, die Echtzeit-Beobachtung der Blase Krebs Invasion ermöglicht die für Krebs Progression und Metastasierung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses System ist offen für die Einbeziehung der verschiedenen Stromazellen und zellulären Komponenten erlauben Ermittler besser zusammenfassend Gewebe Mikroumgebung wo Blase Krebs Invasion stattfindet. Blase Krebs Sphäroide können aus verschiedenen Quellen wie Zell-Linien (einschließlich genetisch veränderter Zelllinien f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten das Labor von Dr. Howard Crawford (University of Michigan) für technische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Ausrüstung für diese Studie und Alan Kelleher für den technischen Support zu danken.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN Jia (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS) finanziert.
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
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