前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。
Summary
ここでは、最初の初乳の授乳と組み合わせて新生児ラット脳における脳核を分離するプロトコルを提案します。この技法は、上皮細胞のシグナリングを用いた変調、脳の栄養不足ストレスの研究をできます。
Abstract
このプロトコルの目的は、最初の初乳の授乳の前後に新生児の脳でオキシトシン受容体豊かな脳核を分離することです。西部にしみが付くことを使用して脳核分離株における代謝ストレス応答する知られていた蛋白質の発現を測定しました。これは、体内代謝ストレス誘発性の栄養不全が神経ストレスをトリガーするかどうかを評価するために行われました。以前新生児の栄養不全が腸内代謝ストレスを引き出すことができた。さらに、初乳オキシトシンは、最初のフィードの前後前に新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジー マーカーを変調します。小胞体ストレスに関連付けられている蛋白質のマーカーをシグナリング [小胞体シャペロン結合免疫グロブリン蛋白質 (BiP) 真核生物翻訳開始因子 2 a (eIF2a) と eIF2a キナーゼ蛋白質キナーゼ R (p PKR)]、2 だけでなく、炎症シグナル伝達蛋白質 [核因子 κ B (NF kB) および阻害剤 κB (IkB)] 新生児脳核測定した [孤 (NTS)、室傍核 (PVN)、スープラ網膜神経核 (息子)、野 (CX)、線条体核 (STR) の核と内側視索前野核 (MPO)] 最初のフィード (初乳处置 p) の前に (初乳によってプライミング) 看護の開始後。Bip/grp78 と p eIF2a の発現はプライミング NTS 組織、处置 p で亢進とダウンレギュ レート。NF kB は、NF kB が低いとそのまま国税庁、PVN と息子の両方の条件に対し CX、STR と MPO の細胞質 (高) 保持されました。集団 BiP と p eIF2 所見は、ストレス応答と一致しています。eIf2a はだった息子、CX、STR、MPO で dsRNA 依存型キナーゼ (PKR-p) によりリン酸化されます。ただし、国税庁 (および PVN でより少ない程度に)、eIf2a は別のキナーゼ、一般制御 nonderepressible 2 キナーゼ (GCN2) によりリン酸化されます。いくつかの OTR の豊富な脳領域でミラー化される以前新生児の腸上皮細胞に見られるストレス変調構造が表示されます。国税庁、PVN 可能性があります他の地域から別のリン酸化機構 (栄養不足) 下を利用し、栄養不足の影響に抵抗性であります。総称して、このデータは、初乳プライミング上皮細胞からのシグナルによって栄養不足ストレス脳応答をオフセットすることを示唆しています。
Introduction
日-週に産後のコース上に発生する初期の脳の発達の理解と対照をなして比較的少し知られている無数のラットでの生活の最初の数時間で発生する動的な変更について。重要な課題は、ラット新生仔脳と離散脳領域または単一の細胞を分離するハイテク ツールのための要件の小さなサイズをされています。研究は、遺伝子の転写と翻訳ではない1,2, 活性化シグナル伝達分子の機能レベルのしっかりした理解を与えていないしばしば評価します。他の人は表現のレベル3の定量化のため許可しない参照脳領域に免疫組織化学を使用して式を調べます。これまでの研究はラットの最初初乳の迅速単離と犠牲と蛋白質の表現、蛋白質のリン酸化を使っている西の測定を要求する離散脳のフィードに関連付けられているシグナルの活性化は検査されません。しみが付きます。古いより大きい頭脳の脳レーザーマイクロダイ セクションが実行、間ない P0 脳の非単一細胞脳パンチを実行する参照を同定しました。比較的小規模なサンプルの蛋白質の表現を測定する比較的ローテクなパンチ法とウエスタンブロット プロシージャを用いた新生児の脳の制限された領域を分離するためのプロトコルを提案する.このプロトコルは蛋白質の表現およびポスト翻訳の修正の評価を必要とする研究課題に適した可能性があります (e.g、リン酸化)、任意の種の小さな脳の比較的制限された地域で提供する、。ユーザーは、アトラスと明確な目標物興味の脳の領域を視覚的に識別できます。
この技術は、フィード、オキシトシン (OT) が豊富である新生児ラットの最初の初乳の結果として脳の変化を理解するために開発されました。OT は、ミルクの失望と子宮の収縮を刺激するために、その能力の長い知られています。しかし、OT は今多くの身体機能や動作4規制の役割の広い範囲を再生する知られています。たとえば、OT が胃排出遅延、腸の通過を遅くにストレスと適応の親和行動5と組み合わせて炎症に反対します。OT 受容体 (OTR) は、腸溶性ニューロンと腸上皮6,7,8で識別されています。OT の消化管の効果は、出生後早期の間に幼児に特に重要です。例えば、母乳は新生児の腸9,10OT の大量の配信に関連付け、データ表示、OTR 大きくにおいて過剰発現十二指腸絨毛ミルク哺乳期間8時。
そのオキシトシン シグナリング経路11,12ストレスに重要な分子を調節してタンパク質の翻訳で規制の役割を果たして、細胞レベルで実証しているの腸細胞株を用いたin vitro実験12. これらの研究は、母親からの外因性のオキシトシンを含む牛乳の成分、細胞ストレス13を減らすために新生児の小胞体ストレス応答に重要な示唆しています。
体内と体外の研究は、初乳 OT が新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジーのマーカーを調節することを示しています。新生児の腸内細菌叢に初乳14,15と OT9などのホルモンを含む多数の蛋白質の母親から腸を同時に公開する場合の内腔側に実質的なの細胞圧力に苦しむ,10,16。
脳に OT の効果は、研究17をされています。しかし、出生後早期に腸内で示した OT シグナリング メカニズム脳に研究されていません。本稿で新生児ラット脳幹と視床下部の電気泳動を用いた離散脳核を分離するためメソッドを使用して、分離脳の領域をプロファイルします。このメソッドの全体的な目標は、細胞内情報伝達の脳領域誕生、最初のミルクは最小のグリア ・ ニューロン インデックスの脳組織で、授乳の前後にできるだけ近い状態をキャプチャすることです。この技術の開発のための根拠は、自動化された西部のしみを使用して前のヴィヴォ研究のためのニューロンより均質なコレクションと新生児子犬に制限された、微細な脳領域の急速な隔離のためできます。方法論は、比較的小規模な解剖サンプルに非常に一貫した結果を提供しています。前の仕事の欠点 (脳スライスまたは全脳) 総郭清より古い動物18,19を含まれます。若い子犬の脳は、非常にダイナミック、グリア分化を生れの後の波を搭載します。子犬の最初の供給によって影響を受け脳変化を研究するために再現可能な郭清を伴う制限された神経細胞核を勉強が必要です。
脳の発達中の脳の領域への影響はほとんど勉強したに対し、牛乳フィードは通常 (たとえば、腸20,の21)、健康や遺伝子発現への免疫学的および栄養の影響を分析します。腸コレシストキニン受容体迷走リレー脳幹核が細胞内シグナル伝達経路22参考腸に牛乳輸送が脳機能に及ぼす影響を調べた。妊娠23日中に母親の栄養失調に発展途上の新生児脳の脆弱性に関する膨大な文献があるが、ストレスと炎症シグナルは扱われません。重要なは、現在のメソッドは、内臓刺激の迷走神経の中継から初乳の血生まれる刺激を分離する日ゼロ ラット新生児における現象の活用します。これは孤束の未熟な核 (NTS) によって特徴付けられるいわゆるストレス低刺激応答性期間-国税庁、室傍核 (PVN) を制限する出生24,25の直後に視床下部の回路と視索上核 (SON) は、血生まれる刺激に通知します。
このメソッドは複数のシグナル伝達経路の分析に役立つ、脳組織は母親が挑戦されているかどうかに加えて、または治療の任意の種類ではなく、ラットの生後日 0 で収穫される神経細胞に比較的制限妊娠中。リットルは、pre-feeding 信号対フィード初乳の影響を分析できます。豊富な蛋白質収量の比較と脳領域間の信号を比較すると、このメソッドは、毛細血管が蛋白質の抗原の免疫定量と並行でポリペプチド バンドの総蛋白質の毛細血管に決定をできます。このメソッドは、標準的な定量曲線なし同じ抗体と毛細血管あたり総蛋白への参照によって得られた結果の任意の単位を使用して、定量的な比較をできます。異なった抗体によって得られた結果を比較することは、定量的標準曲線を使用して可能です。
このメソッドは、双方向の両方の器官の26の機能に影響を与える可能性、腸と脳との間で発生するシグナル伝達の評価できました。近年27で広範囲にわたって研究されてきた、オキシトシンと食物の摂取の間の関連付けは、増加オキシトシン シグナリングと栄養アベイラビリティの間のリンクをサポートします。これらの研究は、赤字は、視床下部のオキシトシンがシグナル伝達の削減と結合エネルギー コンバース概念もサポートします。
OT の脳活動に及ぼす影響の以前の研究では、迷走神経切断術28耐火が視床下部の PVN、扁桃体、および梨状皮質における Cfo 転写を誘導腸の炎症に誘発を示した。ただし、セクレチンと OT の全身投与は腸28で誘発される炎症反応に対する脳の Cfo 反応を減少しました。これは外因性の OT の効果はおそらくエリア後野6,29を介して運ばれる血液媒介性シグナル分子で、迷走神経のリレー以外のルートで実施された提案しました。
本研究では、腸内で以前に観察した細胞ストレスのシグナル伝達経路は脳で評価されました。順番に及ぼす脳機能、乳成分、保護、又は微生物やその他の代謝物、腸の透過性におよぼす炎症を延期しました。IkB で明確な拮抗の違い BiP シグナリング初乳13によるプライミングの前後に絨毛が見つかりましたと提案を開発する過程で、まだ新生児の脳がこれらの腸の免疫誘導信号を感じるかもしれない。
小胞体ストレスに関連付けられている以前の腸実験で使用されるシグナリング蛋白質のマーカーを測定しました。彼らは小胞体シャペロン BiP、翻訳開始因子 eIF2a (ストレス応答インテグレーター30となる)、eIF2a キナーゼが含まれて-PKR、および 2 つの炎症シグナル伝達蛋白質 (NF kB とその阻害剤、IkB)。
六つの脳領域が分泌する、または OT に応答する大人の能力に基づいて選ばれました。上部髄質にある国税庁は、内臓の入力の最初のリレーで腸31とサイトカインは、おそらく血液生まれて、毒素、隣接する野32を介してホルモンで迷走神経の感覚ニューロンから直接信号を受け取る。PVN、視索上核 (SON), 線条体核 (STR)、大脳皮質 (CX) と内側視索前野核 (MPO) 国税庁を介して腸から信号を受信します。
その結果、細胞ストレス応答初乳プライミング前、PVN と息子と比較して国税庁で異なるが摂餌開始直後すぐ産後の期間中CX のシグナリング、STR と MPO 異なって PVN と息子同様。細胞ストレスと腸内の炎症を調節する前に示した OT の明確な保護機能、脳のいくつかの領域によって検出される可能性が高い。まとめて、データを示す細胞レベルで出産後、最初の時間の間に脳に応答する代謝ストレス栄養不足に関連付けられています。データも表示範囲とフィード初乳の変調効果の方向が地域依存性であること、および彼らの腸の例で示した OT 効果ミラー、いくつかの地域では。
Protocol
Representative Results
Discussion
離散の顕微解剖法、新生児ラット脳における脳核 OTR は、本稿で提示されます。脳内のよ特徴付けられた核内であっても、ニューロンを専門性の高いことも認識されます。特定の OTR の豊富な核を分離するこの再現性の高い方法により、堅牢な仮説のテストします。自動ウェスタンブロッティングを使用して、一貫性と結果の再現性がさらに向上。この技法の制限のまま適度な脳パンチ変動;?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、このプロトコルの準備に彼らの支援のマノン レンジャーとアレクサンドラ ・ シュルツをありがとうございます。
Materials
| Bradford solution | Bio Rad | ||
| Protein lysis kit | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES kits | Protein simple | WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07) | |
| anti-mouse IgG HRP conjugate | Protein simple | ||
| Rabbit anti-phospho-eIF2a | Cell Signaling technology | SER51, 9721 | |
| mouse mAb anti-PKR | Cell Signaling technology | 2103 | |
| Rabbit anti-phospho-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| Rabbit mAb anti-PKR | Cell Signaling technology | 12297 | |
| rabbit mAb anti-GAPDH | Cell Signaling technology | 2118 | |
| mouse mAb anti-phospho-IKB | Cell Signaling technology | 9246 | |
| mouse mAb anti-IKB | Cell Signaling technology | 4814 | |
| rabbit anti-BiP | Cell Signaling technology | 3183 | |
| Rabbit anti GCN2 | Cell Signaling technology | 3302 | |
| Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| pregnant Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | ||
| Punch device | WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
References
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
- Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
- Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
- Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
- Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to “brain-body medicine”. Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
- Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
- Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
- Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
- Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
- Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
- Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
- Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
- Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
- Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?. Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
- Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
- Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
- Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
- Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
- Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
- Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
- Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
- Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
- Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
- Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
- Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
- Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
- Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
- Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
- Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
- Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).
