Évaluer le Stress cellulaire et l’Inflammation dans les noyaux en cerveau sécrétant ocytocine discrète chez le Rat néonatal avant et après la première tétée de Colostrum

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les noyaux de cerveau dans le cerveau de rats néonatals en conjonction avec la première prise de nourriture de colostrum. Cette technique permet l’étude du stress de l’insuffisance des éléments nutritifs dans le cerveau comme modulée par l’entérocyte de signalisation.

Abstract

Le but du présent protocole est d’isoler les nucléi riches de récepteurs de l’ocytocine dans le cerveau néonatal avant et après la première tétée de colostrum. L’expression des protéines connues pour répondre aux stress métabolique a été mesurée dans le cerveau-noyaux isolats à l’aide de Western Blot. Ceci permet de déterminer si l’insuffisance nutritive induite par le stress métabolique dans le corps déclenche stress neuronale. Nous avons déjà démontré que l’insuffisance nutritive chez les nouveau-nés provoque un stress métabolique dans le tube digestif. En outre, l’ocytocine colostrum module marqueurs de réponse, l’inflammation et autophagie cellulaire au stress dans les villosités gut rat nouveau-né avant et après la tétée première. Signalisation des marqueurs de protéines associées au stress du réticulum endoplasmique [protéine chaperon binding immunoglobulin ER (BiP), traduction eucaryote initiation factor 2 a (eIF2a) et l’eIF2a kinase protéine kinase R (p-PKR)], ainsi que deux inflammation-signalisation protéines [facteur nucléaire-κB (NF-kB) et inhibiteur κB (IkB)], ont été mesurées dans les nucléi nouveau-né [noyau du faisceau solitaire (NFS), noyau paraventriculaire (PVN), noyau supra optique (NSO), cortex (CX), striatum noyaux (STR), et noyau préoptique médian (FTU)] avant le premier flux (désamorcé par le colostrum) et après le départ des soins infirmiers (amorcée par le colostrum). Expression de BiP/GRP78 et p-eIF2a ont été positivement en désamorce et réprimés dans le tissu du SNRC apprêté. NF-kB est maintenu (élevé) dans le cytoplasme de la CX, STR et MPO, alors que le NF-kB est plus faible et inchangé en NTS, PVN et fils dans les deux conditions. Le collectif BiP et p-eIF2 conclusions concordent avec une réponse au stress. eIf2a est phosphorylée par dsRNA dependent kinase (p-PKR) dans le fils, CX, STR et MPO. Toutefois, dans le NTS (et dans une moindre mesure en PVN), eIf2a est phosphorylée par une autre kinase, contrôle général nonderepressible-2 kinase (GCN2). Les mécanismes de modulation de stress précédemment observés dans les entérocytes de l’intestin nouveau-né semblent être reflétés dans certaines régions du cerveau OTR-rich. La RNT et PVN peuvent utiliser un mécanisme de phosphorylation différents (sous des carences nutritives) provenant d’autres régions et être réfractaire à l’incidence de l’insuffisance des éléments nutritifs. Ensemble, ces données suggèrent que les réponses cérébrales au stress de l’insuffisance des éléments nutritifs sont décalés de signalisation de colostrum-amorcé des entérocytes.

Introduction

Contrairement à notre compréhension du développement du cerveau qui se produisent au cours des jours à semaines post-partum, relativement peu est connu sur la myriade de changements dynamiques qui se produisent dans les premières heures de vie chez les rats. Un défi important a été la petite taille du cerveau rat néonatal et une exigence pour les outils de pointe isoler les régions cérébrales discrètes ou des cellules isolées. Études évaluent souvent les gènes transcription et la traduction pas^1,2, qui ne donne pas une bonne compréhension des niveaux fonctionnels des molécules de signalisation activées. D’autres examinent l’expression par immunohistochimie de référence des régions du cerveau, qui ne permet pas pour la quantification des niveaux d’expression³. Aucune étude à ce jour a examiné l’activation de la signalisation des voies associées colostrum premier rats’ nourrir dans des régions de cerveau discrets, qui exige d’isolation rapide et de sacrifice et de mesure de l’expression de la protéine et la phosphorylation des protéines à l’aide de Western buvard. Alors que le cerveau microdissection est effectuée sur le cerveau des plus âgés et plus grands, nous n’avons pas identifié une référence à l’exécution d’un coup de poing non-single-cellules cérébrales dans un cerveau de P0. Cet article présente un protocole pour isoler les régions restreintes du cerveau néonatal en utilisant une technique de punch relativement rudimentaire et un Western Blot procédure pour mesurer l’expression de la protéine dans des échantillons relativement faibles. Ce protocole peut convenir pour des questions de recherche qui exigent l’évaluation de l’expression des protéines et des modifications post-traductionnelles (e.g., phosphorylation) dans les régions relativement restreintes de petits cerveaux de toute espèce, à condition que le l’utilisateur peut identifier visuellement la région du cerveau d’intérêt avec un atlas et des points de repère identifiables.

Cette technique a été développée pour comprendre les changements qui se produisent dans le cerveau à la suite de colostrum premier rats néonatals, aliments pour animaux, qui est riche en ocytocine (OT). OT a été longtemps connue pour sa capacité à stimuler la contraction réflexe d’éjection et de l’utérus de lait. Cependant, OT sait maintenant jouer un large éventail de rôles dans la régulation de nombreuses fonctions corporelles et comportements⁴. Par exemple, OT s’oppose le stress et l’inflammation en conjonction avec des comportements adaptatifs affiliatif⁵, retarde la vidange gastrique et ralentit le transit intestinal. Les récepteurs OT (OTR) ont été identifiés dans les neurones entériques et épithélium intestinal^6,7,8. Les effets gastro-intestinaux de OT sont particulièrement importantes pour le nourrisson pendant le début de la période postnatal. Par exemple, l’allaitement est associée à la livraison de quantités importantes d’OT pour le tube digestif néonatal^9,10, et les données montrent que l’OTR est fortement surexprimé dans les villosités duodénales pendant le lait de cochon de lait période⁸.

Des expériences in vitro à l’aide d’une lignée de cellules du tube digestif ont démontré au niveau cellulaire que l’ocytocine module molécules importantes dans le stress signalisation voie^11,12 et joue un rôle régulateur dans la traduction des protéines ¹². ces études suggèrent que les composants du lait, notamment ocytocine exogène de la mère, sont importants dans la réponse dévoilée de protéine chez les nouveau-nés afin de réduire le stress cellulaire¹³.

Des études in vivo et ex vivo ont montré que le colostrum OT module les marqueurs de réponse, l’inflammation et autophagie cellulaire au stress dans les villosités gut rat nouveau-né. Entérocytes nouveau-nés souffrent de stress cellulaire important sur leur côté luminal lorsque l’intestin est exposée simultanément à microbiote de la mère dans le colostrum^14,15 et de nombreuses protéines, y compris les hormones telles que l’OT^{9 , 10 , 16}.

Les effets de l’OT sur le cerveau ont été étudiés¹⁷. Cependant, les mécanismes de signalisation OT a démontré dans le tube digestif au cours de la période postnatale précoce n’ont pas été étudiées dans le cerveau. Dans cet article, une méthode pour isoler des nucléi discrètes dans le tronc cérébral de rat néonatal et l’hypothalamus par électrophorèse est utilisée pour profiler des régions isolées du cerveau. L’objectif général de cette méthode consiste à capturer l’état de la signalisation dans les zones du cerveau aussi près que possible à la naissance, avant et après le premier lait de cochon de lait, dans le tissu cérébral avec l’index le moins élevé de glial/neuronale de cellules. La raison d’être pour le développement de cette technique est qu’elle permet l’isolement rapide restreint, microscopique de régions du cerveau chez les chiots nouveau-nés avec une collection plus homogène des neurones pour ex vivo études utilisant un immunobuvardage automatisé méthodologie, offrant des résultats très cohérents sur relativement petits échantillons disséqués. Une lacune du travail préalable comprend plus brute dissection (tranches de cerveau ou cerveau entier) et les plus anciens animaux^18,19. Le cerveau des jeunes chiots est incroyablement dynamique, avec des vagues de différenciation gliale après la naissance. Afin d’étudier les changements de cerveau influencées par les chiots première alimentation, étudier les noyaux neuronaux restreints avec dissection reproductible est nécessaire.

Flux de lait est généralement analysé pour ses effets immunologiques et nutritionnels sur l’expression de gène ou de santé (par exemple, dans les entérocytes^20,,²¹), alors que son effet sur les zones du cerveau pendant le développement du cerveau est rarement étudié. L’effet de lait transit dans l’intestin sur la fonction cérébrale a été analysée en ce qui concerne le tube digestif la cholécystokinine récepteurs vagaux relais des noyaux du tronc cérébral, mais pas de voies signalisation intracellulaire²². Il y a une vaste littérature sur la vulnérabilité du cerveau en développement du nouveau-né à la malnutrition des mères pendant la grossesse²³, mais les signaux de stress et l’inflammation ne sont pas abordées. Ce qui est important, la méthode actuelle tire parti d’un phénomène chez les nouveau-nés de jour zéro rat qui isole les stimuli de colostrum sang-né de vagal relais de stimuli viscéraux. C’est la période d’hypo-réactivité soi-disant contrainte caractérisée par immatures noyau du faisceau solitaire (NTS)-circuit hypothalamique immédiatement après la naissance^24,25 qui restreint la RNT, noyau paraventriculaire (PVN), et noyau supraoptique (fils) des signaux à des stimuli de sang-né.

Cette méthode est utile pour l’analyse des multiples voies de signalisation et relativement restreint aux cellules neuronales, pourvu que le tissu cérébral est récolté au jour post-natal-0 chez le rat, en plus de savoir si les mères ont été contestées ou non par un quelconque traitement pendant la grossesse. Litières peuvent être analysées pour les effets du colostrum nourrir contre alimentation pré signalisation. Lorsque l’on compare les signaux entre les zones du cerveau avec les pauvres par rapport aux rendements de protéine riche, cette méthode permet de déterminer dans les capillaires-protéines totales des bandes polypeptide dans capillaires sont parallèles au immunitaire-dosage des antigènes protéiques. Cette méthode permet la comparaison quantitative, en unités arbitraires, des résultats obtenus par le même anticorps sans courbes quantitatives standard et en se référant à des protéines totales par capillaire. En comparant les résultats obtenus par les différents anticorps est possible uniquement à l’aide de courbes standard quantitatives.

Cette méthode a permis pour l’évaluation de bidirectionnel de signalisation qui se produisent entre l’intestin et le cerveau et qui peut avoir un impact fonction dans les deux organes²⁶. L’association entre prise d’ocytocine et de la nourriture, qui a été largement étudiée au cours des dernières années²⁷, prend en charge un lien entre l’ocytocine accrue de signalisation et de la disponibilité des nutriments. Ces études soutiennent également le concept de converse que les déficits sont couplés avec des réductions dans la signalisation de l’ocytocine hypothalamique de l’énergie.

Des études antérieures de l’effet de l’OT sur l’activité cérébrale ont démontré que l’inflammation intestinale induite provoquée cFos transcription dans cortex hypothalamique, PVN, amygdale et piriforme, qui est réfractaire à une vagotomie²⁸. Toutefois, une perfusion systémique de l’OT avec la sécrétine diminue la réponse de cFos de cerveau à la réaction inflammatoire provoquée dans le tube digestif²⁸. Cela suggère que l’effet de l’OT exogène a été réalisée par des voies autres que des relais vagales, éventuellement par l’intermédiaire de molécules de signalisation véhiculés par le sang transportés par le biais de l’area postrema^6,29.

Dans cette étude, les voies de signalisation cellulaire au stress qui ont été observés auparavant dans le tube digestif ont été évaluées dans le cerveau. L’hypothèse était que les composants du lait peuvent protéger ou de différer l’effet de l’inflammation sur la perméabilité intestinale en métabolites microbiens, d’autres, et à leur tour, les effets sur le cerveau en fonction. Les différences clairement antagonistes en IkB contre BiP de signalisation trouvés dans les villosités, avant et après l’amorçage par le colostrum¹³, suggèrent que le cerveau des nouveaux-nés, toujours en train de développer, peut-être détecter ces signaux intestinale induite par le colostrum.

On a mesuré des marqueurs protéiques signalisation utilisés dans des expériences antérieures de tube digestif qui sont associés avec le stress du réticulum endoplasmique. Il s’agit notamment de l’escorte ER BiP, translation initiation factor eIF2a (qui sert un stress réponse intégrateur³⁰), eIF2a kinase p-PKR et deux protéines de l’inflammation-signalisation (NF-kB et son inhibiteur, IkB).

Six régions cérébrales selon leur capacité chez l’adulte pour sécréter ou répondre à OT ont été choisies. Le NTS, situé à la médullaire supérieure, est le premier relais de l’entrée viscérale et reçoit signalisation directe des neurones sensoriels vagales dans le tube digestif³¹ et cytokines éventuellement sang-né, toxines et hormones via la zone adjacente-postrema³². Le PVN, noyau supraoptique (fils), striatum noyaux (STR), cortex cérébral (CX) et noyau préoptique médian (FTU) reçoivent de signalisation provenant de l’intestin par l’intermédiaire de l’ent.

Résultats ont montré que la réponse cellulaire au cours de la période postnatale immédiate avant l’amorçage du colostrum et immédiatement après que la première prise de nourriture est différente en NTS comparée à PVN et fils. Signalisation en CX, STR et FTU différaient de celle du PVN et fils, aussi bien. Les fonctions de protection distinctes des OT décrite précédemment pour moduler le stress cellulaire et l’inflammation dans l’intestin sont probablement détectées par certaines régions du cerveau. Collectivement, les données indiquent qu’au niveau cellulaire, pendant les premières heures après la naissance, le cerveau réagit au stress métabolique associé à l’insuffisance des éléments nutritifs. Les données montrent également que la portée et l’orientation des effets modulateurs du colostrum se nourrissent sont axées sur la région et que dans certaines régions, elles reflètent les effets OT montrés précédemment dans le tube digestif.

Protocol

Cette étude a été approuvée par les commissions d’utilisation de Columbia University et le New York State Psychiatric Institute et d’animalier institutionnel. 1. préparation du tissu Commander des rates gravides chronométrés de vendeur. Suivre des rates gravides chronométrés en observant leur abdomen de plus en plus dans les semaines qui suivent leur arrivée et par la suite à la recherche de chiots à la date de livraison prévue en inspectant la cage toutes …

Representative Results

Les bandes représentatives d’immunoréactivité par rapport aux protéines totales montrent qu’il y a des nucléi avec récoltés très pauvre en protéines. Ceci nécessite l’utilisation de la technique automatisée de Western blot, qui est très sensible par rapport à la tache occidentale canonique. Cette approche peut être exécutée avec sino-européen moins de protéines par capillaire par rapport à la voie par dans les transferts Western. <p class="jove_step" fo:keep-t…

Discussion

Une technique pour microdissection Discrete, noyaux de cerveau OTR-riches dans le cerveau de rat néonatal est présentée dans cet article. Il est bien établi que les neurones sont très spécialisés, même à l’intérieur des noyaux bien caractérisés dans le cerveau. Cette approche hautement reproductible pour isoler les noyaux riches en OTR spécifiques permet des tests d’hypothèse robuste. L’utilisation automatisée Éponger occidental, l’uniformité et la reproductibilité des résultats ont été encor…

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50