Мы представляем в естественных условиях двух фотонных изображений протокол для визуализации коры головного мозга у новорожденных мышей. Этот метод подходит для анализа динамики развития корковых нейронов, молекулярные механизмы, которые управляют нейрональных динамики и изменения в нейрональных динамика в модели заболеванием.
Двух фотонных изображений является мощным инструментом для анализа нейронных цепей в мозге млекопитающих в естественных условиях . Однако ограниченное количество в vivo тепловизионные методы существуют для изучения мозговой ткани живых новорожденных млекопитающих. Здесь мы кратко протокол для визуализации отдельных корковых нейронов в живых новорожденных мышей. Этот протокол включает в себя следующие две методологии: (1) системе Сверхновая для разреженных и яркие маркировки корковых нейронов в развивающийся мозг и (2) хирургическая процедура для хрупких новорожденного череп. Этот протокол позволяет наблюдение временных изменений отдельных корковых невритов новорожденных этапах с высоким соотношением сигнал шум. Приклеенные этикетку клеток конкретных генов и нокаут также могут быть достигнуты путем объединения сверхновой РНК-интерференции и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена систем редактирования. Этот протокол может таким образом, использоваться для анализа динамики развития корковых нейронов, молекулярные механизмы, которые управляют нейрональных динамики и изменения в динамике нейронов в модели заболеванием.
Точное проводки нейронных цепей в коре имеет важное значение для высших мозговых функций, включая восприятие, познание и обучения и памяти. Корковых цепи динамически уточняются во время послеродового развития. Исследования изучали процесс корковых цепи формирования с использованием гистологических и в пробирке анализа культуры. Однако динамика формирования цепи в жизни млекопитающих оставалась главным образом неизученными.
Двух Фотон микроскопии широко используется для анализа в vivo нейронных цепей в1,мозг взрослой мыши2. Однако из-за технических проблем, только ограниченное количество исследований рассматривались нейронные цепи формирования у новорожденных мышей. К примеру Каррильо et al. исполнил покадровой съемки восхождения волокна мозжечка в втором послеродовой неделю3. Portera-Кайо et al. сообщили изображений аксоны в коркового слоя 1 в первом послеродовой неделю4. В настоящем исследовании мы суммируем протокол для наблюдения слой 4 корковых нейронов и их дендритов новорожденных мышей. Результаты, полученные путем применения настоящего Протокола, которая включает в себя две методологии, сообщается в нашей недавней публикации5. Во-первых мы используем сверхновой вектор системы5,6 для маркировки отдельных нейронов в головном мозге новорожденных. В системе сверхновой флуоресцентных белков, используется для маркировки нейронов нокдаун гена клеток конкретных сменные и помечены и редактирования/нокаут анализы также возможны. Во-вторых мы описываем хирургическая процедура подготовки черепной окно в хрупких новорожденных мышей. Вместе эти методологии позволяют наблюдения в естественных условиях отдельных нейронов в мозге новорожденных.
Важнейшие шаги в протоколе и устранения неполадок:
Наиболее важным этапом протокола является удаление черепа (протокол шаг 3.2). После вставки лезвие бритвы часто придерживается Дура, вызывая дурального кровотечение и повреждение головного мозга. Этого можно избежать путе…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят т. Сато, м. Kanbayashi и S. Kouyama за их технической помощи. Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP15K14322 и JP16H06143, научный фонд Такэда, Уэхара Мемориальный фонд и проект совместных исследований Ниигата университета мозга исследовательский институт 2017-2923 (H.M.) и по KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 и JP15H04263 и Грант в научных исследований в области инноваций «Динамическое регулирование функции мозга на металлолом и построения системы» (JP16H06459) от МПКСНТ (T.I.).
pK031. TRE-Cre | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from authors |
Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
Titanium bar | Authors | – | Custom made (see Figure 1G) |
Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
Titanium plate | Authors | – | Custom made (see Figure 2A) |
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |