نقدم في فيفو اثنين-فوتون التصوير البروتوكول للتصوير قشرة الدماغ الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب مناسبة لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.
تصوير اثنين-فوتون أداة قوية للتحليل في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الثدييات. ومع ذلك، توجد عدد محدود من أساليب التصوير في فيفو لفحص أنسجة المخ من الثدييات حديثي الولادة الحية. وهنا يمكننا تلخيص بروتوكول لتصوير الخلايا العصبية القشرية فردية في الفئران حديثي الولادة الحية. يتضمن هذا البروتوكول المنهجيتين التالية: (1) نظام سوبر نوفا لوسم متفرق ومشرق للخلايا العصبية القشرية في الدماغ، و (2) إجراء العمليات جراحية للجمجمة الولدان الهشة. ويسمح هذا البروتوكول مراقبة التغيرات الزمنية لفرادى نيوريتيس القشرية خلال مراحل الأطفال حديثي الولادة مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. كما يمكن عن طريق الجمع بين الفائق مع تدخل الجيش الملكي النيبالي والجينات كريسبر/Cas9 تحرير نظم إسكات الجينات الخاصة بخلية مسماة وخروج المغلوب. هذا البروتوكول، وبالتالي، يمكن لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.
الأسلاك الدقيقة من الدوائر العصبية في قشرة الدماغ ضروري لوظائف الدماغ العليا بما في ذلك التصور، والإدراك، والتعلم والذاكرة. الدوائر القشرية المكررة بشكل حيوي أثناء التطوير بعد الولادة. الدراسات وحققت عملية استخدام تشكيل الدائرة القشرية غذائها و في المختبر تحليلات الثقافة. ومع ذلك، ظلت ديناميات تشكيل الدائرة في الثدييات الحية غير مستكشفة في معظمها.
اثنين-فوتون الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للتحليلات في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الماوس الكبار1،2. ومع ذلك، نظراً للتحديات التقنية، سوى عدد محدود من الدراسات تناولت تشكيل الدوائر العصبية في الفئران حديثي الولادة. على سبيل المثال، يقوم كاريو et al. تصوير مرور الزمن تسلق الألياف في المخيخ في الأسبوع بعد الولادة الثانية3. كيليو بورترا et al. عن تصوير محاور عصبية في الطبقة القشرية 1 في أول أسبوع بعد الولادة4. في الدراسة الحالية، ويمكننا تلخيص بروتوكول لمراقبة طبقة 4 القشرية الخلايا العصبية وعلى dendrites في الفئران حديثي الولادة. وترد النتائج التي تم الحصول عليها بتطبيق هذا البروتوكول، التي تتضمن منهجيات اثنين، في لدينا منشور الأخيرة5. أولاً، نحن نستخدم5،نظام ناقل سوبر نوفا6 لوضع العلامات الفردية من الخلايا العصبية في الدماغ الولدان. في نظام سوبر نوفا، البروتينات الفلورية تستخدم لتسمية الخلايا العصبية الجينات الخاصة بخلية قابلة للصرف والمسمى ضربة قاضية وتحليلات التحرير/خروج المغلوب أيضا ممكنة. ثانيا، نحن تصف إجراء العمليات جراحية لإعداد إطار الجمجمة في الفئران حديثي الولادة الهشة. معا، تسمح هذه المنهجيات في فيفو الملاحظة الفردية الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة.
خطوات حاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
أن الخطوة الأكثر أهمية للبروتوكول هو إزالة الجمجمة (الخطوة 3، 2 من البروتوكول). عند الإدراج، تلتزم شفرة حلاقة غالباً دوراً، مما تسبب في نزيف دورال وتلف الدماغ. ويمكن تجنب هذا بإضافة قطره من المخزن المؤقت اللحاء في الجمجمة و?…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون ساتو ت. وم. كانباياشي كوياما س. للمساعدة التقنية. JSPS كاكينهي منحة أرقام JP15K14322 و JP16H06143، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، مؤسسة النصب التذكاري أوهارا، والتعاونية البحوث المشروع من جامعة نيغاتا الدماغ بحوث المعهد عام 2017-2923 (صاحب الجلالة) وتم تأييد هذا العمل JP16K14559 كاكينهي، JP15H01454، و JP15H04263، ومنحة في البحث العلمي في مجالات الابتكار “التنظيم الديناميكي وظيفة المخ بالخردة وبناء نظام” (JP16H06459) من يأمرون (منظمة الشفافية الدولية).
pK031. TRE-Cre | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from authors |
Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
Titanium bar | Authors | – | Custom made (see Figure 1G) |
Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
Titanium plate | Authors | – | Custom made (see Figure 2A) |
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |