Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) является наиболее распространенным лейкемии в западном мире. NFAT транскрипционные факторы являются важными регуляторами развития и активации в многочисленных типах клеток. Здесь мы представляем собой протокол для применения иммунопреципитации chromatin (обломока) в клетках человека CLL для выявления новых целевых генов NFAT2.
Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) характеризуется расширением злокачественные клетки B клонов и представляет собой наиболее распространенных лейкемии в западных странах. Большинство пациентов ХЛЛ показывают праздного течения заболевания, а также anergic фенотип их лейкозных клеток, ссылаясь на B клеточных рецепторов, не реагируют на внешней стимуляции. Недавно мы показали, что фактор транскрипции NFAT2 является важным регулятором анергия в ХЛЛ. Одной из основных задач в анализе роли фактора транскрипции в различных заболеваний заключается в определении своих конкретных целевых генов. Это имеет большое значение для разяснения патогенетических механизмов и потенциальных терапевтических вмешательств. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является классический способ продемонстрировать взаимодействий протеин дна и может таким образом, использоваться для выявления прямых целевых генов факторов транскрипции в mammalian клетках. Здесь чип использовался для выявления LCK как прямой целевого гена NFAT2 в клетках человека ХЛЛ. Связанные белков и ДНК, сшитые с помощью формальдегида и впоследствии стриженый sonication на фрагменты ДНК приблизительно 200-500 пар оснований (ВР). Сшитых фрагментов ДНК, связанные с NFAT2, затем выборочно immunoprecipitated от мусора ячейки с помощью αNFAT2 антитела. После очистки связанные фрагменты ДНК обнаруживаются через Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). Последовательности ДНК с очевидным обогащения представляют регионы генома, которые являются мишенью для NFAT2 в естественных условиях. Соответствующие стрижка ДНК и подбор необходимых антитела являются особенно важное значение для успешного применения этого метода. Этот протокол является идеальным для демонстрации прямого взаимодействия NFAT2 с генов-мишеней. Его основным ограничением является трудность использовать чип в крупномасштабных анализов, анализ генов-мишеней несколько факторов транскрипции в нетронутыми организмов.
Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) представляет собой наиболее распространенных лейкемии у взрослых в западных странах, выставке собственный накопление CD19, CD23 и CD5 выражая зрелые B клетки1. Большинство пациентов выставку праздного течения, которые не требуют специального лечения для многих лет. Напротив некоторые пациенты показать быстрой прогрессии, требующих немедленного терапевтических вмешательств с иммунной химиотерапии или другие целевые терапии2,3. Ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) — семейство контроля развития различных факторов транскрипции и активации процессов в многочисленных ячейка типы4,5,6. Недавно мы продемонстрировали гиперэкспрессия и конституционных активации NFAT2 в клетки CLL от пациентов с праздного болезни7. Здесь он регулирует отвечать государства для стимуляции рецепторов клетки B называется анергия7. Чтобы продемонстрировать, что NFAT2 связывается с лимфоцитов специфические белки тирозин киназы (LCK) промоутер и регулирует LCK выражение в клетках человека ХЛЛ, assay иммунопреципитации конкретные хроматина (чип) разработана и занятых.
Чип представляет один из нескольких методов для изучения роли факторов транскрипции гена выражение8. Экспрессия генов плотно делается очень сложным образом несколькими регуляторами с транскрипционными факторами незаменимой участвуя в этот процесс9,10,и11,12. В многочисленных видов (например, для развития и дифференциации)13,14,15, выявлены транскрипционные факторы, регулирующие экспрессии генов в пространственной и временной контекст 16,17,18. Ошибки в замысловатые контрольных механизмов с участием транскрипционных факторов может привести к различных патологических процессов, включая рак19,20. Следовательно выявление факторов транскрипции и их соответствующие цели может предложить роман терапевтических направлений21,22. Расследовать этот интригующий поле несколько методов доступны как чип, assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA), различные ДНК выпадающее assays и репортер анализов8,11,12, 23 , 24.
Чтобы продемонстрировать, что определенные транскрипционный фактор взаимодействует с конкретными регионами генома в естественных условиях, чип является идеальной техникой25. Для этой цели ДНК и связанных белков в живых клетках сшиты с помощью УФ-облучения и формальдегид (сшитый чип, XChIP). Этот шаг пропускается, для получения лучшего ДНК и белка восстановления в так называемых родной чип (NChIP)26. Комплексы ДНК белок впоследствии стриженый, sonication на фрагменты примерно 200-500 пар оснований (ВР) и immunoprecipitated от мусора ячейки, используя специфическое антитело против транскрипционный фактор интереса. Связанные фрагменты ДНК затем очищенный и характеризуется PCR, молекулярное клонирование и секвенирование. Альтернативные методы использовать microarrays (чип на Chip) или секвенирование нового поколения (чип-Seq) для анализа immunoprecipitated ДНК.
Чип был впервые введен Гилмор и лис в 1984 году, когда они использовали УФ света ковалентно перекрестных ссылок ДНК и связанных белков в живых бактерий27. После лизиса клеток и иммунопреципитации бактериальных РНК-полимеразы конкретных зонды известных генов были использованы для сопоставления в vivo распределения и плотности РНК-полимеразы. Для анализа распределения эукариот РНК-полимераза II на тепловой шок белок генов в дрозофилы28же следователей впоследствии использовался метод. XChIP проба была далее обогащена Варшавский и coworkers, которые впервые используется формальдегид cross-linking учиться ассоциации гистона H4 с тепловой шок белок генов29,30. NChIP подход, который несет в себе преимущества лучше восстановления ДНК и белка из-за естественно нетронутыми эпитопов и, следовательно, большей специфичности антитела, впервые был описан Hebbes и коллеги в 1988 году31.
Преимуществом чип по сравнению с другими методами для анализа ДНК белковых взаимодействий является на самом деле, что фактическое взаимодействие транскрипционный фактор может быть исследованы в естественных условиях и не зондов или искусственные условия, созданные буферов или гели работают8,,1112. Объединив чип с секвенирование нового поколения, одновременно могут быть определены несколько целей.
Основные ограничения этой техники являются его ограниченную применимость для крупномасштабных анализов в неповрежденной организмов25. Анализ картин выражения гена дифференциальных также может быть сложным, с использованием методов чип, если соответствующие белки выражаются только на низком уровне или в ходе узких временных окон. Еще одним потенциально ограничивающим фактором является наличие соответствующих антител, подходит для чипа11.
Протокол чип, представленные здесь может быть использован для идентификации генов-мишеней транскрипционного фактора в vivo Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). В частности цель заключалась в выявлении новых целевых генов NFAT2 в ХЛЛ. Чип был выбран за его потенциал непосредственно продемонстрировать привязку NFAT2 промоутер регионам различных целевых генов в естественных условиях в клетках человека ХЛЛ пациента.
Важнейшие шаги выполнения успешно пробирного чип являются выбор соответствующей антитела и оптимизации хроматина, стрижка процесса25. Выбор αNFAT2 антитела оказалось особенно сложным во время разработки этого протокола. Хотя есть несколько αNFAT2 антител коммерчески доступн?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана DFG Грант му 3340/1-1 и Deutsche Krebshilfe Грант 111134 (оба присуждена M.R.M.). Мы благодарим Elke Malenke за отличную техническую помощь).
1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
FBS superior | Merck | S0615 | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |