만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.
만성 림프모구 백혈병 (CLL) 악성 B 세포 복제품 확장 특징 이다 고 서방 국가에서 가장 흔한 백혈병을 나타냅니다. CLL 환자의 대다수는 질병의 나태 한 과정 뿐만 아니라 그들의 백혈병 세포의 anergic 형 B 세포 수용 체 외부 자극에 응답을 참조를 표시 합니다. 우리는 최근 녹음 방송 요인 NFAT2 CLL에 아의 중요 한 레 귤 레이 터가 나타났습니다. 다른 질병에서 녹음 방송 요인의 역할의 분석의 주요 과제는 그것의 특정 대상 유전자의 id입니다. 이 pathogenetic 메커니즘 및 잠재적인 치료 내정간섭의 해명에 대 한 큰 의미입니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 단백질 DNA 상호 작용을 설명 하는 고전적인 기법 이며 포유류 세포에 있는 녹음 방송 요인의 직접적인 대상 유전자를 식별 하는 데 따라서 수 있습니다. 여기, 칩 인간 CLL 세포에 NFAT2의 직접적인 대상 유전자로 LCK 를 식별 하기 위해 사용 되었다. DNA와 관련 된 단백질 포름알데히드를 사용 하 여 가교 된 이며 이후 쥡니다 대략 200-500의 기본적인 쌍 (bp)의 DNA 파편에 의해 전단. NFAT2와 관련 된 상호 연결 된 DNA 파편은 다음 선택적으로 αNFAT2 항 체를 사용 하 여 셀 파편에서 immunoprecipitated. 정화, 후 관련된 DNA 파편은 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 검색 됩니다. 분명 농축 된 DNA 시퀀스 NFAT2에서 비보에의해 타겟으로하는 게놈의 지구를 대표 한다. DNA와 필요한 항 체의 선택의 적절 한 전단 하는 것이이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 특히 중요 합니다. 이 프로토콜은 대상 유전자와 NFAT2의 직접적인 상호 작용의 데모에 이상적입니다. 그것의 주요 한계는 그대로 생물의 여러 전사 인자 들의 대상 유전자 분석 대규모 분석에 칩을 사용 하는 데 어려움.
만성 림프모구 백혈병 (CLL) 나타냅니다 서방 국가 있는 성인에서 가장 흔한 백혈병,1세포 성숙 B 표현 CD19, CD23, 그리고 CD5의 고유한 축적을 전시. 대부분의 환자 들은 몇 년에 대 한 구체적인 치료를 필요로 하지 않는다는 나태 한 질병 과정을 전시 한다. 반면, 일부 환자는 면역 화학요법 또는 다른 표적으로 한 치료2,3즉각적인 치료 내정간섭을 요구 하는 빠른 진행을 보여줍니다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요소는 다양 한 발달을 조절 하는 전사 인자와 수많은 셀 종류4,,56활성화 프로세스의 집합입니다. 우리가 최근에7나태 한 질병 가진 환자에서 overexpression 헌법의 및 활성화 CLL 세포에 NFAT2 보여 주었다. 여기, 그것은 라는 아7B 세포 수용 체 자극에 응답 하지 않는 상태를 조절. NFAT2에 림프 톨 특정 단백질 티로신 키 니 아 제 (LCK) 발기인 및 인간 CLL 세포, 특정 chromatin immunoprecipitation 분석 결과에서 LCK 식 조절 (칩) 개발 및 고용.
칩은 유전자 표현8에 녹음 방송 요인의 역할을 조사 하기 위해 여러 가지 기술 중 하나. 유전자 발현은 밀접 하 게이 과정9,10,,1112에 대신할 참여 하는 전사 인자와 매우 복잡 한 방식으로 여러 규제에 의해 조율 된. 공간과 시간적 맥락에서 유전자 발현을 조절 하는 전사 인자에 수많은 종 (예를 들어, 개발 및 차별화)13,,1415, 발견 되었습니다. 16,,1718. 오류와 관련 된 녹음 방송 요인 복잡 한 제어 메커니즘에 암19,20를 포함 하 여 pathologic 프로세스의 다양 한 발생할 수 있습니다. 따라서, 녹음 방송 요인 및 그들의 각각 대상의 식별 소설 치료 길21,22를 제공할 수 있습니다. 이 흥미로운 분야를 조사 하기 위해 여러 가지 방법을 칩, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 다양 한 DNA 풀 다운 분석 실험 및 기자-분석 실험8,,1112, 처럼 사용할 수 있습니다. 23 , 24.
특정 전사 인자는 게놈의 특정 지역 상호 작용 입증을 vivo에서 칩 이상적인 기술25입니다. 이 위해 DNA와 살아있는 세포에 관련 된 단백질은 십자가 UV 방사선 조사 또는 포 름 알 데히드 (상호 연결 된 칩, XChIP)를 사용 하 여. 이 단계는 더 나은 DNA 및 단백질 복구 소위 기본 칩 (NChIP)26에서 생략 됩니다. DNA 단백질 복합물은 이후 약 200-500의 기본적인 쌍 (bp)와 관심의 녹음 방송 요인에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 셀에서에서 immunoprecipitated의 파편으로 쥡니다에 의해 전단. 그리고 나 서 연결 된 DNA 파편 정화 PCR, 분자 클로닝 및 시퀀싱에 의해 특징. 대체 기술을 사용 하 여 microarrays (칩-온-칩) 또는 다음-세대 시퀀싱 (칩 Seq) immunoprecipitated DNA를 분석.
칩 길모어에 의해 처음 도입 및 1984 그들은 UV를 사용 하는 경우에 Lis covalently 상호 연결 DNA 빛과 생활에 단백질을 바운드 박테리아27. 세포 세포의 용 해 및 세균성 RNA 중 합 효소의 immunoprecipitation, 알려진된 유전자의 특정 프로브는 vivo에서 유통 및 RNA 중 합 효소의 밀도 매핑하는 데 사용 되었다. 방법은 진 핵 RNA 중 합 효소 II 열 충격 단백질 유전자 초파리28의 분포를 분석 하 같은 수 사관에 의해 연속적으로 사용 되었다. XChIP 분석 결과 Varshavsky와 동료 처음 열 충격 단백질 유전자29,30와 H4 히스톤의 협회를 공부 cross-linking 포름알데히드를 사용 하 여 더 세련 되었다. 때문에 자연스럽 게 그대로 epitopes 더 나은 DNA와 단백질 복구의 이점을 운반 NChIP 접근 및, 따라서, 더 큰 항 체 특이성, 처음 Hebbes와 동료 198831에 의해 설명 되었다.
칩의 DNA 단백질 상호 작용 분석을 다른 기술에 비해 장점은 사실, 녹음 방송 요인의 실제 상호 작용 수 조사 비보에 아무 프로브 또는 버퍼 또는 젤에 의해 만들어진 인공 조건 8,,1112고용. 차세대 시퀀싱 칩을 결합 하 여 여러 개의 목표를 동시에 확인할 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 그대로 생물25에 대규모 분석을 그것의 제한 적용. 도전만 수준 낮은 또는 좁은 시간 창 동안 각각 단백질 표현 됩니다 경우 칩 기술을 사용 하 여 차동 진 식 패턴의 분석 될 수 있습니다. 또 다른 잠재적으로 제한 요인은 적절 한 항 체 칩11적합의 가용성 이다.
여기에 제시 된 칩 프로토콜 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)으로 대상 유전자의 녹음 방송 요인의 비보에 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 특히, 목표 CLL에 NFAT2의 소설 대상 유전자를 확인 했다. 칩은 직접 인간의 CLL 환자 세포의 자연 조건 하에서 다른 대상 유전자의 발기인 지구에 NFAT2의 바인딩을 보여에 그것의 잠재력 때문에 선택 되었다.
성공적인 칩 분석 실험을 수행의 중요 한 단계는 적절 한 항 체의 선택과 과정25전단 chromatin의 최적화. ΑNFAT2 항 체의 선택이이 프로토콜의 개발 중 특히 어려운 것으로 판명. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 αNFAT2 항 체와이 작품 부 럽 잘 및 다른 응용 프로그램의 대부분은, 복제 7A6 칩7성공적으로 사용 될 수 있는 유일한 항 체 했다. 도 살 일 걸 요 다른 제조 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 DFG에 의해 지원 되었다 뮤 3340/1-1과 도이치 Krebshilfe 111134 (둘 다 M.R.M.에 게 수 여 하는) 부여 부여. 우리 감사 Elke Malenke 우수한 기술 지원).
1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
FBS superior | Merck | S0615 | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |