Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales
Summary
Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.
Abstract
Activé des neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), qui peuvent capturer et détruire les microbes. Des études récentes suggèrent que les filets sont impliqués dans divers processus morbides, comme auto-immunes métastases maladie, thrombose et la tumeur. Ici, nous montrons une technique détaillée in vitro pour détecter les activités NET durant le piégeage des cellules tumorales libre, ce qui poussent après fixation de filets. Tout d’abord, nous avons recueilli des neutrophiles faible densité (LDN) du liquide de lavage péritonéal postopératoire des patients qui ont subi les laparotomies. Culture à court terme de la LDN a entraîné formation nette massive qui a été visualisée avec nucléaire vert fluorescent et contre-colorant chromosome. Après incubation Co de lignées cellulaires de cancer de l’estomac humain MKN45, IC-1 et NUGC-4 avec les filets, nombreuses cellules tumorales ont été piégés par les filets. Par la suite, la pièce jointe a été complètement abrogée par la dégradation des filets avec la DNase I. décomposée vidéo a révélé que les cellules tumorales, pris au piège par les NETs ne sont pas mort mais a grandi au contraire vigoureusement dans une culture continue. Ces méthodes peuvent être appliquées à la détection des interactions adhésives entre les filets et les différents types de cellules et de matériaux.
Introduction
Neutrophiles nucléaires polymorphe dans le sang circulant sont généralement séparés de cellules mononucléaires via la méthode de préparation de gradient de densité. Toutefois, certains neutrophiles appelés neutrophiles faible densités (LDN), avec des phénotypes CD11b(+), CD15(+), CD16(+) et CD14(-), sont conjointement purifiées avec des cellules mononucléaires. Le nombre relatif de LDN augmente de manière significative dans diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes1,2, septicémie3et cancer4,5. Des études antérieures ont montré que LDN constituent une classe phénotypiquement et fonctionnellement distincte de neutrophiles6. Il est à noter que LDN dans le sang circulant sont plus susceptibles de produire des pièges extracellulaires neutrophiles (filets) que la densité normale neutrophiles2,7. Les filets sont des structures de toile d’araignée composés d’acides nucléiques, histones, protéases et protéines granulaires et cytosoliques, et ils peuvent efficacement piéger et détruire les agents pathogènes8.
Récemment, les filets ont démontré pour capturer non seulement les microbes, mais aussi les plaquettes et circulation de cellules tumorales qui peuvent aider à thrombus formation9 et tumeur métastases10,11. Cependant, les mécanismes moléculaires interactions adhésives entre les filets et les plaquettes ou les cellules tumorales sont encore peu claires. Plus récemment, un essai d’adhérence in vitro ont révélé que les cellules de la leucémie myéloïde (K56212) et de cellules de carcinome du poumon (A54913) attachent à filets via les intégrines β1 et β3. Les auteurs ont utilisé le stock NET isolés des neutrophiles et activé par phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme l’adhérence substrat14. Bien que ce test permet de détecter des interactions réelles avec composantes nettes en l’absence des neutrophiles, on peut affirmer si la « acellulaire stock NET » isolé par centrifugation à haute vitesse est toujours la structure moléculaire identique à filets produits dans vivo. Récemment, nous avons trouvé ce liquide de lavage péritonéal après que chirurgie abdominale contenait de nombreux LDN mature, qui généré des filets massives et attachés aux cellules tumorales causant des métastases péritonéales,15. Dans cette étude, nous avons examiné avec succès l’adhérence des cellules tumorales aux filets intacts sans aucune manipulation physique. Ici, nous montrons les détails d’une technique pour détecter des interactions adhésives entre les filets et les cellules tumorales gratuit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des études antérieures ont signalé que les cellules tumorales circulantes peut être piégé par des substrats NET en vivo10,,11. Les cellules de cancer du sein métastatique ont été démontrés pour stimuler des neutrophiles et induisent la formation des filets, qui contribue à la croissance des cellules tumorales dans les organes de cible17. En outre, nous avons constaté que les cultures à court terme de LDN de liquide d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme J. Shinohara et I. Steve de travail technique et clérical. Aussi, nous remercions les Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina et Kazuya Takahashi pour leur coopération pour acquisition d’échantillon en salle d’opération. Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique du ministère de l’éducation, Science, Sports et Culture du Japon et la société japonaise pour la Promotion de la Science (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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