Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage
Summary
Hier presenteren we een methode waarin menselijke low-density neutrofiele granulocyten (LDN), postoperatieve peritoneale lavage vloeistof, verhaald produceren enorme neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en efficiënt trap gratis tumorcellen die vervolgens groeien.
Abstract
Geactiveerd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die kunnen vangen en microben te vernietigen. Recente studies suggereren dat de netten zijn betrokken bij verschillende ziekteprocessen, zoals auto-immune ziekte, trombose en tumor uitzaaiingen. Hier, laten we een gedetailleerde in vitro -techniek netto activiteit tijdens de vangst van gratis tumorcellen, die na gehechtheid aan netten groeien detecteren. Ten eerste, wij lage dichtheid neutrofiele granulocyten (LDN) van postoperatieve peritoneale lavage vloeistof van patiënten die onderging laparotomies verzameld. Op korte termijn kweken van LDN resulteerde in enorme netto formatie die werd gevisualiseerd met groen fluorescent nucleaire en chromosoom-counterstain. Na een incubatieperiode van Co van menselijke maagkanker cellijnen MKN45, OCUM-1 en NUGC-4 met de netten, werden vele tumorcellen opgesloten door de netten. Vervolgens de bijlage volledig werd afgeschaft door de afbraak van netten met DNase I. tijd-tijdspanne video geopenbaard dat tumorcellen gevangen door de netten niet sterven, maar in plaats daarvan krachtig groeide in een continue cultuur. Deze methoden kunnen worden toegepast op de detectie van zelfklevende interacties tussen netten en verschillende soorten cellen en materialen.
Introduction
Polymorf nucleaire neutrofielen in het bloed circuleren zijn het meestal gescheiden van mononucleaire cellen via de dichtheid kleurovergang voorbereiding methode. Sommige neutrofiele granulocyten bekend als low-density neutrofiele granulocyten (LDN), met CD11b(+), CD15(+), CD16(+) en CD14(-) fenotypen, zijn echter mede gezuiverde met mononucleaire cellen. Het relatieve aantal LDN aanzienlijk verhoogt in verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune ziekten1,2, sepsis3en kanker4,5. Eerdere studies hebben aangetoond dat LDN een fenotypische en functioneel verschillend soort neutrofielen6. Opgemerkt moet worden dat LDN in het circulerende bloed hebben meer kans op produceren neutrofiele extracellulaire vallen dan normale dichtheid neutrofielen2,7(netten). Netten zijn web-achtige structuren samengesteld van nucleïnezuren, histonen, proteasen en korrelig en cytosolische eiwitten, en ze kunnen efficiënt vangen en het vernietigen van ziekteverwekkers8.
Onlangs, netten zijn gebleken om vast te leggen niet alleen microben, maar ook bloedplaatjes en circulerende tumorcellen die bij trombose vorming9 en tumor uitzaaiingen10,11 helpen kunnen. De moleculaire mechanismen achter de zelfklevende interacties tussen netten en bloedplaatjes of tumorcellen zijn echter nog onduidelijk. Meer recentelijk, een hechting in vitro assay geopenbaard dat myeloïde leukemie cellen (K56212) en Long carcinoom cellen (A54913) aan netten via β1 en β3 integrins hechten. De auteurs gebruikt NET voorraad geïsoleerd van neutrofielen en geactiveerd door phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als de hechting substraat14. Hoewel deze test maakt de ontdekking van echte interactie met netto componenten in de afwezigheid van neutrofiele granulocyten, is het betwistbaar of de “cel-vrij NET voorraad” geïsoleerd door middel van centrifugeren high-speed behoudt de molecuulstructuur identiek aan netten geproduceerd in vivo. Onlangs, vonden we dat peritoneale lavage vloeistof na abdominale heelkunde vervatte veel volwassen LDN, die enorme netten gegenereerd en gekoppeld aan tumorcellen peritoneale metastasen15veroorzaakt. In deze studie onderzochten we met succes de hechting van de tumorcellen aan intact netten zonder enige fysieke manipulatie. Hier, laten we details van een techniek voor het detecteren van zelfklevende interacties tussen netten en gratis tumorcellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies hebben gemeld dat circulerende tumorcellen kan worden gevangen door netto substraten in vivo10,11. Metastatische borstkanker kankercellen is gebleken stimuleren neutrofielen en vorming van netten, die in de groei van de cel van de tumor in de target orgel17 helptinduceren. Daarnaast vonden we dat op korte termijn culturen van LDN van postoperatieve lavage vloeistof geproduceerd enorme netten die efficiënt tumorcel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken mevrouw J. Shinohara en I. Nieda voor technische en administratieve werkzaamheden. Wij danken ook, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta Kentaro Kurashina en Kazuya Takahashi voor hun samenwerking voor monster acquisitie in de operatiekamer. Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek van het ministerie van onderwijs, wetenschap, sport, en cultuur van Japan en de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
