PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning
Summary
Un tempo, accurato e riproducibile efficiente quantitativa PCR (qPCR) metodo per enumerare fago T7 è descritto qui. Il protocollo descrive chiaramente la preparazione di DNA genomico dei fagi, preparazione di reazione di PCR, qPCR ciclismo condizioni e analisi dei dati di qPCR.
Abstract
Questo protocollo descrive l’uso della PCR quantitativa (qPCR) per enumerare T7 fagi da esperimenti di selezione dei fagi (cioè, “biopanning”). qPCR è un approccio basato su fluorescenza per quantificare il DNA, e qui, è adattato a quantificare i genomi dei fagi come un proxy per particelle dei fagi. In questo protocollo, un metodo di preparazione del DNA dei fagi facile è descritto mediante riscaldamento ad alta temperatura senza ulteriore purificazione del DNA. Il metodo deve solo piccoli volumi di fagi trattato termicamente e piccoli volumi di reazione qPCR. qPCR è alto-rendimento e veloce, in grado di elaborare e ottenere dati da una piastra a 96 pozzetti delle reazioni in 2 – 4 h. rispetto ad altri metodi di enumerazione dei fagi, qPCR è più efficiente in termini di tempo. Qui, qPCR viene utilizzato per enumerare T7 fagi identificati da biopanning contro il modello in vitro fibrosi cistica-come muco. Il metodo di qPCR può essere esteso per quantificare T7 fagi da altri esperimenti, compresi altri tipi di biopanning (ad es., screening di fagi immobilizzato il legame con le proteine, in vivo ) e da altre fonti (ad esempio, sistemi di acqua o fluidi corporei). In sintesi, questo protocollo può essere modificato per quantificare eventuali virus DNA-incapsulato.
Introduction
Tecnologia di visualizzazione del batteriofago (fago), sviluppata da George Smith nel 1985, è un approccio potente, ad alta produttività per identificare ligandi del peptide o della proteina contro bersagli o recettori dalla membrana cellulare, gli antigeni malattia, organelli cellulari o specifici organi e tessuti in passato due decenni1,2. Qui, librerie casuale di polipeptidi o singola catena anticorpi vengono visualizzate sulle proteine cappotto di fagi (in genere M13 o T7) e ligandi specifici possono essere identificati da panning contro proteine immobilizzate in vitro o in vivo sistemi biologici attraverso un processo di selezione iterativi. Quindi, ligandi possono essere accoppiati con agenti terapeutici o di imaging per la diagnosi ed il trattamento di malattie3,4. È fondamentale per enumerare accuratamente fagi durante più passaggi di biopanning: (1) per quantificare i fagi che si legano al substrato e (2) quantificare fagi per determinare se c’è l’arricchimento con ogni turno di selezione (arricchimento dei fagi indica biopanned affinità dei fagi per la destinazione). Il gold standard attuale per la quantificazione, saggio della placca doppio strato, presenta sfide multiple; è noioso, ingombrante e potenzialmente non accurati per un gran numero di campioni. Di conseguenza, il nostro gruppo ha sviluppato un metodo di reazione a catena (qPCR) della polimerasi quantitativa sensibile, riproducibile, preciso e rapido per enumerare le particelle dei fagi M13 e T7 da biopanning5.
qPCR è un metodo attraente e fattibile quantificare con precisione T7 e M13 fagi. Poiché ogni particella individuale dei fagi può contenere solo una copia del DNA genomico (dsDNA o ssDNA), uno dei fagi genoma è equivalente a una particella fago; quantificando il numero di genomi dei fagi, è fattibile quantificare il numero di fagi. Durante qPCR, reporter fluorescente tinture legano il DNA genomico dei fagi non specifico o in particolare attraverso gli iniettori sequenza-specifici durante l’amplificazione di PCR e la fluorescenza segnale aumenta con ogni ciclo di amplificazione. Quando il segnale di fluorescenza raggiunge la soglia, che turno/ciclo di amplificazione è noto come il ciclo di soglia (Ct). Le concentrazioni note di fago riferimento DNA vengono confrontate con i valori di Ct per stabilire una curva standard. Utilizzando la curva standard con i valori di Ct di campioni di DNA, le concentrazioni di fagi possono essere interpolate.
Mentre numerose strategie sviluppate in precedenza e ampiamente utilizzate per quantificare i fagi da biopanning, ognuno di loro ha specifiche sfide. Il metodo più popolare e convenzionale è saggio della placca doppio strato. Qui, alcuni batteri sono infettati con fagi preparati alle diluizioni seriali, sono placcati su un substrato solido agar e sono overlaid con agar; fagi vengono enumerate con il numero delle placche formate (cioè, unità di formazione di placca o pfu) sulla piastra di agar. Saggio della placca è sensibile ma noioso, che richiede tempo e imprecise, soprattutto per i numerosi campioni e con alte concentrazioni di5. Inoltre, analisi enzima-collegate dell’immunosorbente (ELISA) sono state adattate per enumerare M13 e T7 fago particelle6,7,8. Qui, fagi a varie diluizioni sono vincolati e catturato su un substrato solido (cioè, una micropiastra), sondato con gli anticorpi dei fagi-specific e rilevato utilizzando reporter (ad es., substrati cromogeni sensibili enzima, fluorofori) per determinare il numero di particelle fagiche presenti. Letture (ad es., fluorescenza, assorbanza) dei campioni possono essere utilizzate per quantificare le concentrazioni sconosciute contro gli standard dei fagi a concentrazioni note. Sono state sviluppate diverse basati su fagi ELISAs ma hanno limitazioni potenziali. Un gruppo ha sviluppato un panino cartacei ELISA con una gamma di quantificazione che durò sette ordini di grandezza (2-10 109 pfu/mL); Tuttavia, questo metodo necessari più passaggi di rivestimento dell’anticorpo ed ha preso per un’intera giornata per il dosaggio di8. Anche il nostro gruppo ha sviluppato un metodo per quantificare le particelle dei fagi M13 ma aveva una gamma meno sensibile di rilevazione di 106 a 1011 pfu/mL5. Commutabile lantanidi fluorescenza sonde sono state sviluppate per enumerare M13 e quantificazione dati potrebbero essere ottenuti entro 20 min; Tuttavia, questo test ha una gamma dinamica stretta di 109 al 1012 pfu/mL9. Un gruppo ha usato Microscopia a forza atomica per enumerare le particelle dei fagi M13 in soluzione, ma questo richiede la microscopia elettronica avanzata e funzionava solo all’interno di una ristretta gamma di concentrazioni10. Un altro studio ha utilizzato monodispersi emulsioni per intrappolare fagi reporter fluorescente M13 e T4 e contare i fagi per il numero di goccioline fluorescente; Tuttavia, questo approccio inoltre hanno esibito una gamma stretta quantificazione da 102 106 pfu/mL11. Mentre gocciolina che digitale PCR è stato utilizzato per quantificare i fagi M13, questo approccio è in grado di distinguere tra il numero di malattie infettive e non infettive dei fagi particelle12.
Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato metodi qPCR per enumerare T7 e M13 fagi identificati da biopanning contro un modello di cellulare della barriera emato – encefalica utilizzando due diversi reporter fluorescente tinture5. Rispetto ai metodi di quantificazione di cui sopra, i metodi di qPCR abbiamo sviluppato erano ad alta velocità e tempo efficiente per quantificare numerosi campioni e in grado di distinguere tra fagi infettive e non infettive con dnasi I pre-trattamento della campioni dei fagi. Cosa importante, questo approccio può riproducibile e accuratamente quantificare batteriofagi M13 e T7 da campioni di biopanning. Per guidare i ricercatori alle prime armi nella zona di fago qPCR, qui descriviamo un metodo qPCR dettagliate per enumerare le particelle dei fagi T7 da una libreria di cisteina-vincolato (CX7C) stroncate contro una barriera muco in vitro della fibrosi cistica (CF). Da questo lavoro, qPCR metodo può essere esteso per quantificare le particelle dei fagi da altri tipi di biopanning e da altre fonti, tra cui acqua, il suolo e fluidi corporei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato metodi di qPCR per quantificazione di DNA genomico dei fagi5, e qui abbiamo descritto e adattato un metodo qPCR per enumerare T7 fagi selezionati contro una barriera di CF-come muco. Informazioni minime per le linee guida di pubblicazione di quantitativa Real-Time PCR esperimenti (MIQE) sono stati adattati per sviluppare e validare il metodo qPCR per l’enumerazione di T7 fagi15. Il protocollo che abbiamo sviluppato per quantificare i fagi da esperimenti d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da PhRMA Foundation Research Grant Starter e cuore nazionale, polmone e sangue Institute of National Institutes of Health concedere sotto numero premio R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
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