以此 T7 噬菌体的定量 PCR 研究
Summary
本文介绍了一种可重现的、准确的、时间有效的定量 PCR (qPCR) 方法来枚举 T7 噬菌体。该协议明确描述了噬菌体基因组 DNA 制备、PCR 反应制备、qPCR 循环条件和 qPCR 数据分析。
Abstract
该协议描述了定量 PCR (qPCR) 从噬菌体选择实验 (即“以此”) 中枚举 T7 噬菌体的应用。qPCR 是一种基于荧光的方法来量化 DNA, 在这里, 它被用来量化噬菌体基因组作为噬菌体粒子的代理。在该协议中, 用高温加热技术描述了一种简便的噬菌体 dna 制备方法, 无需额外的 DNA 纯化。该方法只需要少量的热处理噬菌体和小体积的 qPCR 反应。qPCR 是高通量和快速, 能够处理和获取数据从96井的反应在 2–4 h. 与其他噬菌体枚举方法相比, qPCR 更有时间效率。在这里, qPCR 用于列举从以此中识别出的 T7 噬菌体对体外囊性纤维样粘液模型。qPCR 方法可以扩展, 以量化 T7 噬菌体从其他实验, 包括其他类型的以此 (e.,固定化蛋白结合, 体内噬菌体筛选) 和其他来源 (例如,水系统或体液)。总之, 这个协议可以修改, 以量化任何 DNA 封装病毒。
Introduction
噬菌体 (噬菌体) 显示技术, 由乔治·史密斯在1985年开发, 是一个强大的高通量的方法, 以识别肽或蛋白质配体的目标或受体从细胞膜, 疾病抗原, 细胞器或特定器官和组织在过去二年1,2。这里, 在噬菌体 (通常是 M13 或 T7) 的外壳蛋白上显示多肽或单链抗体的随机库, 在体外或体内对固定蛋白的平移可以识别出特定的配体。生物系统通过一个迭代选择过程。然后, 配体可以与影像或治疗药物结合, 以诊断和治疗疾病3,4。在以此的多个步骤中准确地列举噬菌体是非常关键的: (1) 量化噬菌体与基底和 (2) 量化噬菌体, 以确定是否有丰富的每一轮选择 (噬菌体浓缩表明 biopanned目标的噬菌体亲和性)。目前对定量、双层斑块检测的黄金标准提出了多重挑战;它是繁琐的, 繁琐的, 可能是不准确的大量样本。因此, 我们小组开发了一种灵敏、可重复、准确、高效的定量聚合酶链反应 (qPCR) 方法, 用于从以此5中列举 M13 和 T7 噬菌体粒子。
qPCR 是准确定量 T7 和 M13 噬菌体的一种具有吸引力和可行性的方法。由于每个单独的噬菌体粒子只能包含一份基因组 DNA (dsDNA 或 ssDNA), 一个噬菌体基因组相当于一个噬菌体粒子;通过量化噬菌体基因组的数量, 可以量化噬菌体的数量。在 qPCR 期间, 荧光记者染料在 PCR 扩增过程中, 不专门或具体通过序列特异引物结合噬菌体基因组 DNA, 荧光信号随着每轮放大而增加。当荧光信号达到阈值时, 放大的圆形/循环被指出为阈值周期 (Ct)。已知浓度的参考噬菌体 DNA 被绘制反对他们的 Ct 值, 以建立一个标准曲线。将标准曲线与 DNA 样本的 Ct 值结合, 可以对噬菌体的浓度进行插补。
虽然以前已经制定了许多战略, 并广泛地用于从以此中定量噬菌体, 但每一个都有具体的挑战。最常用和最常用的方法是双层斑块法。在这里, 宿主细菌感染了在串行稀释制备的噬菌体, 被镀在固体琼脂基体上, 并与琼脂覆盖;噬菌体被列举的斑块的数量 (即斑块形成单位或 pfu) 在琼脂板块。斑块检测是敏感但繁琐, 耗时和不准确的, 特别是对许多样品和高浓度5。此外, 酶联免疫吸附检测 (ELISA) 已经适应了列举 M13 和 T7 噬菌体粒子6,7,8。在这里, 不同稀释的噬菌体被绑定并捕获在固体基底上 (即微板块), 用噬菌体特异抗体进行探测, 并使用记者 (例如,酶敏感的显色基质, 显影) 来确定存在的噬菌体粒子数量。样品的读数 (如荧光、吸光度) 可以用来量化已知浓度下的噬菌体标准的未知浓度。不同的噬菌体为基础的 ELISAs 已经开发, 但它们有潜在的局限性。一个小组开发了以纸为基础的三明治 ELISA, 其量化范围跨越七级 (102-109 pfu/毫升);然而, 这种方法需要多步骤的抗体涂层, 并采取了整整一天的化验8。我们的小组还开发了一种 ELISA 方法, 以量化 M13 噬菌体粒子, 但有一个不太敏感的 检测范围为 10 6 至 1011 pfu/毫升5。已开发出可切换的镧系荧光探针, 用于枚举 M13, 可在20分钟内获得量化数据;然而, 这种检测有一个狭窄的动态范围为 109至 1012 pfu/毫升9。一组使用原子力显微镜在溶液中列举 M13 噬菌体粒子, 但这需要先进的电子显微镜, 只有在10的浓度范围内工作。另一项研究使用单分散乳液诱捕荧光 M13 和 T4 报告噬菌体和计数噬菌体的数量的荧光液滴;然而, 这种方法也显示了一个狭窄的量化范围从 102到 106 pfu/毫升11。当液滴数字 PCR 用于定量 M13 噬菌体时, 这种方法无法区分传染性和非传染性噬菌体粒子的数量12。
我们的小组最近开发了 qPCR 方法, 以列举 T7 和 M13 噬菌体从以此识别的血脑屏障细胞模型使用两种不同的荧光记者染料5。与上述量化方法相比, 我们开发的 qPCR 方法是高通量和时间效率的数量众多的样本, 并能够区分传染性和非传染性噬菌体与 DNase I 预处理的噬菌体样本。重要的是, 这种方法可以重现性和准确地量化 M13 和 T7 噬菌体从以此样本。为指导在噬菌体 qPCR 领域的新手研究人员, 这里我们描述了一个详细的 qPCR 方法来列举 T7 噬菌体颗粒从半胱氨酸约束的图书馆 (CX7C) 对体外囊性纤维化 (CF) 粘液屏障。从这项工作, qPCR 方法可以扩展, 以量化的噬菌体粒子从其他类型的以此和其他来源, 包括水, 土壤和体液。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们开发了 qPCR 方法来量化噬菌体基因组 DNA5, 在这里我们描述和适应了一个 qPCR 的方法, 以列举 T7 噬菌体选择对类似 CF 粘液屏障。发布定量实时 PCR 实验 (MIQE) 指南的最低信息用于开发和验证 T7 噬菌体15的 qPCR 方法。我们从以此实验中量化噬菌体的协议是一种时间高效、可靠、经济的方法。我们的 qPCR 样品制备协议只使用高温处理 (100 °c, 15 分钟) 的噬菌体溶液…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 PhRMA 基金会研究启动补助金和国家心脏, 肺和血液研究所的国家卫生研究院授予编号 R01HL138251。
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
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