Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Summary

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Abstract

Cardiomyocytes gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC-CMs) são uma ferramenta emergente em pesquisa cardiovascular. Ao invés de ser uma população homogênea de células, o iPSC-CMs gerado pelos protocolos de diferenciação atual representam uma mistura de células com ventricular-, atrial-e nodal, como fenótipos, que dificulta a análise fenotípica. Aqui, um método para opticamente registro de potenciais de ação, especificamente do tipo ventricular iPSC-CMs é apresentado. Isto é conseguido pelo Lentivirus transdução com uma construção em que um indicador de tensão geneticamente codificado está sob o controle de um elemento promotor específico ventricular. Quando iPSC-CMs são transfectadas com essa construção, o sensor de tensão é expressa exclusivamente em ventricular células, permitindo gravações de potencial de membrana óptico subtipo específico usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo.

Introduction

Cardiomyocytes (CMs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma ferramenta emergente para dissecar os mecanismos moleculares da doença de coração, para investigar novas terapias e a tela para drogas cardíacos adversos efeitos^{1,2 ,3}. Desde o início, arrhythmogenic doenças como canalopatias têm sido um importante foco desta área de investigação⁴. Consequentemente, métodos para investigar fenótipos elétricos do CMs, como arritmias ou alterações em morfologias do potencial de ação (AP), são o cerne desta tecnologia.

Uma consideração importante na aplicação de iPSC-CMs é que protocolos de diferenciação cardíaca atual não resulta em uma população homogênea de células. Em vez disso, eles são uma mistura de células, assemelhando-se a nó sinusal, atrial e CMs ventriculares em diferentes níveis de maturação^5,6,7,8. Esta heterogeneidade pode ser uma fonte relevante de variabilidade experimental, especialmente se são investigados parâmetros como duração de AP (APD), que intrinsecamente diferem entre os subtipos CM (por exemplo, a APD é menor no atrial do que em CMs ventriculares). A abordagem convencional para resolver este problema é para investigar único iPSC-CMs usando o método de braçadeira do remendo e classificar cada célula como nodal-, atrial-, ou como ventricular, com base na sua morfologia AP⁹. Qualquer análise subsequente pode ser restringido em seguida para as células que representa o subtipo CM de interesse. A grande desvantagem dessa estratégia é seu throughput limitado e a falta de escalabilidade. Além disso, a natureza invasiva da eletrofisiologia de braçadeira do remendo não permite a imagem das mesmas células sequencialmente durante períodos de tempo prolongado.

Aqui, nós fornecemos detalhes experimentais em um método¹⁰ desenvolvido para imagem opticamente APs em subtipos específicos de iPSC-CMs. Isso supera o problema da heterogeneidade do subtipo e aumenta drasticamente o throughput em comparação com os métodos convencionais, permitindo a rápida fenotipagem de iPSC-CMs carregando variantes genéticas ou sendo agentes expostos a farmacológica.

Visão geral da abordagem de imagem óptica subtipo específico

Um indicador de tensão geneticamente codificado (GEVI), cujas propriedades de fluorescência mudam após a despolarização e repolarização da membrana celular, é usado para imagem opticamente alterações do potencial de membrana da CMs. O GEVI aplicado aqui é a proteína fluorescente sensor de voltagem VSFP-CR¹¹, que consiste em um domínio transmembrana sensor de tensão, fundido a um par de um verde (trevo) e uma proteína fluorescente vermelha (mRuby2) (figura 1A). Devido a grande proximidade dos dois fluorophores, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma fração da energia da excitação sendo transferida para a proteína fluorescente vermelha através de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Portanto, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma emissão de ambos o verde e as proteínas fluorescentes vermelhas (figura 1A, painel superior). Quando a célula depolarizes, um rearranjo estrutural do sensor de tensão ocorre que se traduz em uma reorientação das duas proteínas fluorescentes, aumentando a eficiência do FRET. Assim, ainda mais a energia de excitação é transferida de verde para a proteína fluorescente vermelha (figura 1A, painel inferior). Como resultado, em uma célula despolarizada, a emissão de fluorescência verde é redutor, e a emissão de fluorescência vermelha é mais brilhante do que em uma célula no potencial de membrana (figura 1B) a descansar.

Figura 1: imagem ótica da membrana potencial com CR. VSFP (A), A diagrama esquemático mostrando a ação da proteína fluorescente sensível à tensão QUE VSFP-CR é mostrado. Após a despolarização da membrana celular, um rearranjo estrutural no domínio transmembranar do sensor de tensão se traduz em uma reorientação do verde (GFP) e vermelha (RFP) fluorescente da proteína, aumentando a eficiência da intramolecular Förster transferência de energia de ressonância (FRET). Espectros (B) a emissão de um VSFP em cima da excitação da GFP em células com o potencial de membrana de repouso (painel superior) e em células despolarizadas (painel inferior) são retratados. A mudança espectral após a despolarização é exagerada para maior clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As mudanças na eficiência FRET espelhando as flutuações do potencial de membrana são fotografadas usando um microscópio de fluorescência, equipado com um divisor de imagem, que separa a emissão de fluorescência vermelha e verde e projeta-los sobre duas áreas adjacentes de o chip de uma câmera de sCMOS (Figura 2). Com esta configuração, a emissão de fluorescência em duas bandas de comprimento de onda diferente pode ser gravada simultaneamente, que permite o cálculo de um rácio de fluorescência verde-vermelho-para refletir o potencial em cada imagem de uma lapso de tempo série de membrana.

Figura 2: configuração do sistema de geração de imagens. Os principais componentes do sistema de imagem usados para imagem as mudanças espectrais da proteína fluorescente tensão sensível as alterações de potencial de membrana em uma alta resolução temporal de espelhamento são retratadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A expressão de VSFP-CR em CMs é conseguida Lentivirus transdução. Para direcionar a expressão para o subtipo CM de interesse, o lentivirus contém um elemento de promotor (o MLC2v enhancer) que especificamente drives transcrição em ventricular como iPSC-CMs¹⁰. Quando o iPSC-CMs que representam uma mistura de células semelhantes a atrial, nodal, como e ventricular, como é transfectado com este lentivirus, VSFP-CR é expresso apenas nas células como ventricular. Uma vez que a imagem latente ótica potencial de ação depende deste sensor fluorescente, os potenciais de ação gravados exclusivamente representam o subtipo CM de interesse (Figura 3).

Figura 3: expressão de VSFP orientada por promotor para a imagem latente de potencial de membrana do subtipo específico. (um) este esquema mostra como gravações de potencial de ação óptico subtipo específico de casos são atingidas. (b) iPSC-CMs infectados com um VSFP sob o controle do atrapalha-MLC2v ventricular específicas são mostrados. A expressão do sensor de tensão é observada somente em CMs ventricular, como no canal de GFP (painel esquerdo). O contraste de fase (painel central) e a imagem de superposição (painel direito) também são fornecidos. Linhas brancas pontilhadas marcam limites da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. preparação dos Cardiomyocytes iPSC-derivado para a imagem latente Nota: Métodos de diferenciação de cultura e cardíaca de iPSC foram publicados antes de12,13,14 e não serão discutidos aqui em detalhes. A purificação de iPSC-CMs microdissection manual, separação magnética celular ou seleção de lactato é recomendada, dependendo do protocolo de diferenciação utilizado. Para o seguinte …

Representative Results

Na figura 4a, um único representante iPSC-CM é retratado com as linhas pontilhadas brancas marcando o ROI desenhado durante a análise de imagem na RFP (lado esquerdo) e o canal GFP (lado direito). O sinal do canal RFP mostra um aumento periódico em intensidade fluorescente durante cada potencial de ação (figura 4b, painel superior). Conforme descrito na introdução, este é devido a uma crescente FRET causado por alteraç?…

Discussion

O método descrito aqui permite que uma gravação óptica de APs de um subtipo específico (ou seja, células ventriculares) de CMs gerado a partir de iPSCs humana. IPSC-CMs humanos são uma ferramenta emergente para resolver uma enorme variedade de problemas biológicos e médicos, e a diferenciação de diferentes subtipos de CM é uma importante fonte de variabilidade experimental. Usando elementos específicos do promotor, a expressão de um GEVI especificamente é alcançada em CMs que representa o subtipo…

Materials

ß-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 Medium	Invitrogen	21331046
FBS(Fetal Bovine Serum)	Invitrogen	16141079
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140050
GlutaMax-I Supplement	Invitrogen	35050061	alternative L-Glutamine
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Fibronectin bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Collagenase type II	Worthington Biochem	LS004174
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268	enhancing lentiviral infection
3.5 cm glass-bottom microdishes	MatTek corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
Microscope stand	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI6000B
Microscope objective	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil
sCMOS camera	Andor Technology, Belfast, UK	Zyla V
Microscope filter cube: excitation filter	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	bandpass 480/40
Microscope filter cube: dichroic mirror	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	longpass 505 nm
Image splitter	Cairn Research, Faversham, UK	OptoSplit II
Image splitter filter cube: dichroic mirror	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	568LPXR	longpass 568 nm
Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	520/28 BrightLine HC	bandpass 520/28 nm
Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	630/75 ET Bandpass	bandpass 630/75 nm
Pacing inset	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	RC-37FS