人诱导的多潜能干细胞源性心室心肌细胞亚型特异光学动作电位记录
Summary
在这里, 我们提出了一种光学图像动作电位的方法, 特别是在心室样诱导多潜能干细胞衍生心肌细胞。该方法基于对电压敏感的荧光蛋白的启动子驱动表达式。
Abstract
由人类诱导的多潜能干细胞 (iPSC CMs) 产生的心肌细胞是心血管研究的新兴工具。目前的分化协议所产生的 iPSC-CMs, 与其说是同质的细胞群, 不如说是细胞与心室、心房和结节样表型的混合体, 这就复杂了对表型的分析。本文提出了一种从心室样 iPSC-CMs 的光学记录动作电位的方法。这是通过慢病毒载体转导与一个结构, 其中一个基因编码的电压指示器是在一个心室特定的启动子元素的控制。当 iPSC CMs 与此构造转基因时, 电压传感器只表达在心室样细胞中, 使用时间失效荧光显微镜使亚型特定的光学膜电位记录得以实现。
Introduction
由诱导多能干细胞 (iPSCs) 衍生的心肌细胞 (CMs) 是一种新的工具, 用于解剖心脏疾病的分子机制, 研究新的治疗方法, 并筛查1、2 的不良心脏药物效应。,3。从一开始, 致心律失常疾病如 channelopathies 已经成为这个研究领域的一个重要的焦点4。因此, 研究 CMs 电子表型的方法, 如心律失常或动作电位 (AP) 形态的变化, 是该技术的核心。
在应用 iPSC CMs 的一个重要的考虑是, 目前的心脏分化协议并没有导致细胞的同源种群。相反, 它们是在不同的成熟度5,6,7,8, 类似窦房结, 心房和心室 CMs 的细胞的混合物。这种异质性可能是实验变异性的相关来源, 特别是如果研究了 AP 持续时间 (apd) 的参数, 这在 CM 亚型 (例如, 在心房的 APD 比心室 CMs 短)。解决这一问题的常规方法是使用膜片钳方法调查单个 iPSC CMs, 并根据 AP 形态学9将每个细胞分类为节、心房或心室状。随后的任何分析都可以限制为表示感兴趣的 CM 子类型的单元格。该策略的主要缺点是其吞吐量有限, 且缺乏可伸缩性。而且, 膜片钳电生理学的侵入性不允许在延长的时间段内按顺序对同一细胞进行成像。
在这里, 我们提供的实验细节的方法10发展到光学图像 ap 的特定亚型 iPSC CMs。这克服了亚型异质性的问题, 大大增加了与传统方法相比的吞吐量, 允许快速分型 iPSC CMs 携带遗传变种或接触到药理制剂。
亚型特定光学成像方法综述
一种基因编码的电压指示器 (GEVI), 其荧光特性在细胞膜的退极化和复极化上发生变化, 用于 CMs 膜电位的光学图像变化。GEVI 在这里应用的是电压传感荧光蛋白 VSFP-CR11, 它包括一个电压传感跨膜领域融合到一对绿色 (三叶草) 和红色 (mRuby2) 荧光蛋白 (图 1A)。由于两个显影的接近, 绿色荧光蛋白的激发会导致激发能量的一小部分通过Förster 共振能量转移 (烦恼) 转移到红色荧光蛋白中。因此, 绿色荧光蛋白的激发导致了绿色和红色荧光蛋白的排放 (图 1A, 上部板)。当细胞 depolarizes 时, 电压传感器的结构重排发生转化为两种荧光蛋白的重新定位, 提高了烦恼的效率。因此, 更多的励磁能量从绿色转移到红色荧光蛋白 (图 1A, 下板)。因此, 在偏振光细胞中, 绿色荧光发射是变暗, 红色荧光发射比在静止膜电位下的细胞更亮 (图 1B)。
图 1: VSFP 膜电位的光学成像.(a) 显示了一种描述电压敏感荧光蛋白 VSFP 的作用的示意图。在细胞膜的退极化后, 电压传感跨膜领域的结构重排转化为绿色 (GFP) 和红色 (RFP) 荧光蛋白的重新定位, 提高分子内 Förster 的效率。共振能量传递 (烦恼)。(B) 描述了 VSFP 在静止膜电位 (上板) 和偏振光细胞 (下板) 的细胞中激发 GFP 的发射光谱。在退极化时的光谱变化被夸大为清晰。请单击此处查看此图的较大版本.
在焦虑效率的变化, 镜像的波动, 膜电位的影像是使用一个荧光显微镜配备了图像分配器, 分离红色和绿色的荧光排放, 并将其投射到两个相邻的区域sCMOS 相机的芯片 (图 2)。利用这一设置, 可以同时记录两个不同波长波段的荧光发射量, 从而能够计算出一个时间序列的每一个图像中的红-绿荧光比值来反映膜电位。
图 2: 成像系统的配置.描述了成像系统的主要组成部分, 用于图像的电压敏感荧光蛋白的光谱变化镜像的薄膜电位变化的高时间分辨率。请单击此处查看此图的较大版本.
慢病毒载体转导实现了 VSFP 在 CMs 中的表达。为了直接表达对 CM 亚型的兴趣, 慢病毒北疆包含一个启动器元素 ( MLC2v增强), 特别推动转录在心室样 iPSC-CMs10。当 iPSC-CMs, 代表心房样, 节样, 和心室样细胞的混合转基因与此慢病毒北疆, VSFP CR 只表达在心室样细胞。由于光学动作电位成像依赖于这种荧光传感器, 记录的动作电位完全代表了 CM 亚型的兴趣 (图 3)。
图 3: 用于子类型特定的膜电位成像的启动子驱动的 VSFP 表达式.(a) 这个示意图显示了心肌细胞亚型特定的光学动作电位记录是如何实现的。(b) VSFP 在心室特异 MLC2v-enhancer 控制下感染 iPSC 的 CMs。电压传感器的表达仅观察到 GFP 通道中的心室样 CMs (左面板)。还提供了相位对比度 (中间板) 和叠加图像 (右面板)。白色虚线标记单元格边界。请单击此处查看此图的较大版本.
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的方法允许从人类 iPSCs 生成 CMs 的特定子类型 (即心室样细胞) 中的 ap 进行光学记录。人类 iPSC-CMs 是一个新兴的工具, 以解决巨大的各种生物和医学问题, 和分化不同的 CM 亚型是一个重要的来源的实验变异性。通过使用特定的启动子元素, GEVI 的表达式在 CMs 中具体实现, 表示感兴趣的子类型, 然后进行光学成像。
从单 iPSC CMs 中成功获取 ap 取决于分离后的补种密…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了德国研究基金会 (Si 1747/1-1)、其他 Kröner-费森尤斯基金会和德意志基金会的资助。
Materials
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS(Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS | |
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