Summary

В пробирке Дифференциация мыши гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующий фактор (ГМ КСФ)-производящ клетки T вспомогательный (THGM)

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол дифференцировать мышиных granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) хелперы из клеток CD4 + T наивно, включая изоляции наивно CD4 + Т-клеток, дифференциация THGM, и анализ дифференцированных клеток THGM. Этот метод может применяться для изучения положения и функции клеток THGM.

Abstract

Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)-производство клеток T вспомогательный (THGM) является подмножеством недавно выявленных вспомогательные клетки T, что преимущественно выделяет ГМ-КСФ без производства Гамма интерферон (ИФН) или интерлейкина (IL) -17 и оказывается играть важную роль в аутоиммунных neuroinflammation. Метод изоляции клеток CD4 + T наивно от одноклеточного приостановления splenocytes и поколения клетки THGM от наивного CD4 + Т-клеток было бы полезным методом в исследовании T клеточный иммунитет и аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем метод, который отличает мыши наивно CD4 + Т-клеток в клетки THGM, пропагандируемые IL-7. Итоги дифференциация оценивалась путем анализа выражения цитокинов, с использованием различных методов, включая внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии, количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА). Используя протокол дифференциация THGM как описано здесь, около 55% клеток выразил ГМ-КСФ с минимальным выражением IFNα или ил-17. Преобладающим выражение ГМ-КСФ клетками THGM далее подтверждается анализ экспрессии и ГМ-КСФ, IFNα, Ил-17 уровня мРНК и белка. Таким образом, этот метод может использоваться для различения наивно клеток CD4 + T THGM клеток в пробирке, которые будут полезны в изучении биологии клетки THGM.

Introduction

Хелперы CD4 + T (TH) являются важнейшими компонентами иммунной системы, что решающую роль в принимающей обороны против патогенных микроорганизмов, наблюдения рак и аутоиммунные заболевания1,2,3. После активации клеток T рецептор (TCR) наивно CD4 + Т-клеток могут быть дифференцированы в TH1, T 2H, TH 17, или регулирования T (Treg) клеток под влиянием различных цитокинов кругах2,4, 5. Недавно, новый подмножество клеток TH , который преимущественно производит ГМ-КСФ, определены и назвал THGM6. Дифференцировка клеток THGM обусловлено IL-7 путем активации сигнала датчика и активатор транскрипции 5 (STAT5). Эти клетки выразить большое количество ГМ-КСФ имея низкий выражение других TH-клетки подпись цитокинов, таких как IFNγ и IL-176. Было установлено, что ГМ-КСФ играть решающую роль в развитии CD4 + Т клеток опосредованной neuroinflammation7,8. По сравнению с IFNγ – или ил-17-выражая аутореактивная Т-клеток, ГМ-КСФ выражая T клетки передана одичал тип (WT) мышей вызвало ранее заболевания и более высокой тяжести заболевания. Кроме того клетки T Csf2– / – не побудить Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) после восприимчивую передается WT получателям, тогда как Т-клетки, не хватает IFNγ или ил 17а сохранили способность посредником ЕАЕ7. Кроме того блокада ГМ-КСФ использование нейтрализующих антител смягчены ЕАЕ болезни тяжести8. Кроме того дефицит STAT5 в Т-клетки мышей привело в уменьшилось поколения THGM и, следовательно, сопротивление мышей ЕАЕ развития6. Эти выводы подчеркивают важность ГМ-КСФ выражая TH клеток в neuroinflammatory аутоиммунных заболеваний. Таким образом установление метода дифференцировать ГМ-КСФ выражая TH клетки от наивного CD4 + Т-клеток было бы важно в изучении патогенеза аутоиммунного neuroinflammation и T клеточного иммунного ответа. Однако протокол, эффективно создает THGM клетки из мышиных наивен, что CD4 + установлено не было.

Здесь мы представляем метод, который отличает мышиных THGM клетки от наивного CD4 + Т-клеток. Этот протокол описывает всю процедуру, включая извлечение хандры от мыши, подготовка одноклеточных подвеска, выбор положительный CD4, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и клеток TH дифференциация и анализа. Дифференцированные Т-хелперы анализируются внутриклеточных цитокинов, пятнать в сочетании с проточной цитометрии определить выражение cytokine на уровне одной ячейки, Количественная ПЦР в реальном времени чтобы определить выражение cytokine на уровне мРНК, и по ELISA оценить выражение cytokine уровня белка. Этот метод может применяться для исследования биологии клетки THGM в различных условиях, таких как ЕАЕ, где ГМ-КСФ играет важную роль в патогенезе.

Protocol

Все мыши, используемые в настоящем протоколе были на фоне генетических C57BL/6 и размещается в определенных условиях свободной от возбудителя в национальном университете Сингапура. Все эксперименты проводились с использованием протоколов, одобренных институциональный уход животных и и…

Representative Results

Наивный CD4 + Т-клеток, изолированных от двух 8-недельных самцов мышей C57BL/6 были разделены на три части. Одна часть клеток была дифференцированной в клетки THGM после описанных протокол. Другая часть была культивированный под условие THGM присутствии антитела ант…

Discussion

Здесь мы описали протокол в vitro THGM дифференциации от мыши наивно CD4 + клеток, следуют анализ дифференцированных клеток для проверки метода. Следует отметить селезенке и лимфатических узлах может использоваться для наивного CD4 + Т-клеток очистки и THGM дифференциации. Выраж…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано субсидий из национального университета здравоохранения системы Сингапура (T1-2014-Окт-12 и 10 сентября T1-2015).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

View Video