Summary

في المختبر التفريق بين الماوس المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز عامل (GM-CSF)-إنتاج خلايا مساعد (GMحتي) T

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للتفريق بين الخلايا مساعد (GMحتي) T جرانولوسيتيماكروفاجيكولونيستيمولاتينجفاكتوربرودوسينج مورين من السذاجة خلايا CD4 + T، بما في ذلك عزل من السذاجة خلايا CD4 + T، التفريق بين الآلية العالمية،حتي وو تحليل متمايزة جنرال موتورزحتي الخلايا. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة بتنظيم ووظيفة خلايا تيحالآلية العالمية.

Abstract

عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)-إنتاج الخلية مساعد (GMحتي) T عبارة عن مجموعة فرعية خلية مساعد تي محددة حديثا التي يغلب عليها الطابع تفرز GM-CSF دون إنتاج الانترفيرون (IFN) γ أو انترلوكين (إيل)-17 وهو العثور على تلعب دوراً أساسيا في نيوروينفلاميشن الذاتية. وستكون وسيلة لعزل خلايا CD4 + T ساذجة من تعليق خلية واحدة من سبلينوسيتيس وجنرال موتورزحتي الجيل خلية من خلايا CD4 + T السذاجة تقنية مفيدة في دراسة الخلية T بوساطة الحصانة وأمراض المناعة الذاتية. هنا يصف لنا أسلوب الذي يميز الماوس السذاجة خلايا CD4 + T إلى خلايا تيحجنرال موتورز تعززه إيل-7. وقيمت نتائج المفاضلة بتحليل التعبير السيتوكينات باستخدام تقنيات مختلفة، بما في ذلك داخل الخلايا سيتوكين تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، كمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، و فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). استخدام بروتوكول التمايز تيحالآلية العالمية كما هو موضح هنا، أعرب حوالي 55% الخلايا GM-CSF مع تعبير الحد أدنى من IFNα أو إيل-17. وأكد التعبير السائد عن GM-CSF بخلايا تيحالآلية العالمية كذلك تحليل التعبير عن GM-CSF، و IFNα، وايل-17 على الصعيدين مرناً والبروتين. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب التفريق بين خلايا CD4 + T السذاجة أن تيحجنرال موتورز الخلايا في المختبر، التي ستكون مفيدة في دراسة بيولوجيا الخلية GMحتي.

Introduction

خلايا CD4 + T مساعد (رح) مكونات أساسية للنظام المناعي، ولها دور حاسم في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض الميكروبية وفي مراقبة السرطان والمناعة الذاتية1،،من23. عند تنشيط مستقبلات (تكر) خلية T، يمكن أن تكون متباينة السذاجة خلايا CD4 + “تي” في تيححتي 2، تيح 17، أو تنظيم خلايا T (تريغ) تحت تأثير سيتوكين مختلف الأوساط2،4، 5. في الآونة الأخيرة، تم التعرف على مجموعة فرعية جديدة من خلايا تيح ، التي تنتج غالباً GM-CSF، واسمه جنرال موتورزحتي6. التفريق بين الخلايا المعدلة وراثياحتي تحركها إيل-7 من خلال تفعيل محول الإشارات ومنشط للنسخ 5 (STAT5). هذه الخلايا التعبير عن كمية كبيرة من GM-CSF حين وجود تعبير منخفضة من غيرها تيح-خلية السيتوكينات التوقيع مثل IFNγ وايل-176. تم العثور على GM-CSF تلعب دوراً حاسما في تطوير خلايا CD4 + T الخلية بوساطة نيوروينفلاميشن7،8. مقارنة مع IFNγ–أو إيل-17-الإعراب عن الخلايا أوتوريكتيفي T، معربا عن GM-CSF تي الخلايا المحولة إلى البرية من نوع الفئران (WT) تسبب ظهور أمراض سابقة وشدة المرض أعلى. وبالإضافة إلى ذلك، فشل خلايا تي Csf2–/–حمل النخاع الذاتية التجريبية (إي) بعد نقله أدوبتيفيلي إلى المستلمين WT، بينما خلايا تي التي تفتقر إلى IFNγ أو إيل-17A الإبقاء على القدرة على التوسط EAE7. وعلاوة على ذلك، تحسن حصار GM-CSF باستخدام الأجسام المضادة لتحييد خطورة المرض إي8. وعلاوة على ذلك، عن نقص في STAT5 في خلايا تي في الفئران في جيل تيحجنرال موتورز تقلص، ومن ثم، في مقاومة الفئران ع التنمية6. هذه النتائج تؤكد أهمية التعبير عن GM-CSF تيح الخلايا في أمراض المناعة الذاتية نيوروينفلاماتوري. وهكذا، سيكون إنشاء طريقة للتفريق بين الخلايا معربا عن GM-CSF تيح من السذاجة خلايا CD4 + T هامة في دراسة إمراضية neuroinflammation الذاتية والاستجابات المناعية T الخلية بوساطة. ومع ذلك، بروتوكول أن كفاءة يولد الخلايا المعدلة وراثياحتي من السذاجة مورين CD4 + لم يثبت.

نقدم هنا أسلوب الذي يميز موريني جنرال موتورزحتي الخلايا من خلايا CD4 + T ساذجة. هذا البروتوكول وصف الإجراء بأكمله، بما في ذلك استخراج الطحال من الماوس، وإعداد تعليق خلية واحدة والتحديد خلايا CD4 إيجابية، والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، والخلية تيح التمايز والتحليل. خلايا T المتباينة على مساعد يتم تحليلها بواسطة سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي لتحديد التعبير سيتوكين على مستوى خلية واحدة، قبل بكر كمية في الوقت الحقيقي لتحديد التعبير سيتوكين المستوى مرناً، و بإليزا لتقييم التعبير سيتوكين في مستوى البروتين. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة ببيولوجيا الخلايا تيحالمعدلة وراثيا تحت ظروف مختلفة، مثل ع، حيث الآلية العالمية-الخدمات القطرية دوراً هاما في نشوء المرض.

Protocol

جميع الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول على الخلفية الوراثية C57BL/6 ويضم تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض في “جامعة سنغافورة الوطنية”. جميع التجارب التي أجريت باستخدام البروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة “جامعة سنغافورة الوطنية”. 1-كاشف وإعدا?…

Representative Results

تم تقسيم خلايا CD4 + T ساذج المعزولة من الفئران الذكور C57BL/6 اثنين عمرها 8 الأسبوع إلى ثلاثة أجزاء. كان يميز جزء واحد من الخلايا إلى خلايا تيحجنرال موتورز بعد البروتوكول وصف. وكان مثقف جزء آخر تحت شرط GMحتي حضور الأجسام المضادة-إيل-4 (10 ميكروغرام/مل) لاختبار تأثير حصا…

Discussion

هنا يمكننا وصف بروتوكول في المختبر جنرال موتورزحتي التمايز من الماوس السذاجة CD4 + الخلايا، متبوعاً بتحليل الخلايا المتمايزة للتحقق من صحة الأسلوب. ملاحظة، يمكن استخدام الطحال والغدد الليمفاوية السذاجة CD4 + تي خلية تنقية والتمايز جنرال موتورزحتي. كانت المستحث التعبير سيتو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا الدراسة المنح المقدمة من “جامعة الصحة نظام سنغافورة الوطنية” (T1-2014-12 أكتوبر وسبتمبر T1-2015-10).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

View Video