이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.
Phosphoproteomics phosphorylated 단백질의 대규모 연구를 포함 한다. 단백질 인 산화 많은 신호 전달 경로에서 중요 한 단계 이며, 단단히 kinases와 가수분해에 의해 규제 됩니다. 따라서, 특성화는 phosphoproteome 소설 목표 및 종양 치료를 위한 생체 식별에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 질량 분석 세계적으로 감지 하 고 독특한 인 산화 이벤트의 수천을 계량 하는 방법을 제공 합니다. 그러나, phosphopeptides는 비-phosphopeptides, 더 도전 하 생 화 확 적인 분석 보다 훨씬 풍부. 이 한계를 극복 하기 위해 방법 질량 분석 분석 전에 phosphopeptides를 풍부 하 게 하는 필요 합니다. 우리는 추출 및 펩 티 드, phosphotyrosine (평)와 phosphoserine/트레오닌 (pST) 펩 티 드 항 체 기반을 사용 하 여 또는 이산화 티타늄 (티 오2)에 대 한 농축 뒤를 조직에서 단백질을 소화 하는 절차를 설명-기반 농축 방법입니다. 샘플 준비 질량 분석 후, 우리는 연속적으로 식별 하 고 phosphopeptides 액체 크로마토그래피-질량 분석 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량.
약된 165000 새로운 케이스 및 약 29000 사망자 2018 대표 하는 가장 일반적인 암과 미국1에 남성 암 관련 된 죽음의 두번째 주요한 원인이 전립선 암 때문에 발생 합니다. 전립선 암의 초기 단계는 기관 수감 질병, 10 년 재발 률 20%와 40% 전립선을 받아야 하는 환자와 30%와 50% 방사선을 받을 환자 사이 사이의 절제술 또는 방사선 치료로 치료할 수 있다 치료2. 때문에 안 드로 겐 성장을 위한 신호에 의존 하는 전립선 암, 수술, 화학적 거세 치료 또한 위험이 높은 환자에 대 한 고용 됩니다. 그러나, 재발 발생 암 안 드로 겐 박탈 요법을 생화학 적 재발에 의해 입증 이상 응답 어디에서 혈 청 전립선 특정 항 원 다시 상승 합니다. 이 시점에서 진행, 전이 종종 감지 됩니다. 이 고급 단계, 전이성 거세 내성 전립선 암 이라고 예 지가 2 년3보다는 더 적은의 평균 생존 시간이 질병의 치명적인 형식을 나타냅니다. 몇 가지 치료 옵션이 docetaxel 같은 화학 요법 taxane 기반 뿐만 아니라 enzalutamide와 abiraterone, 2 세대 antiandrogens를 포함 하 여 단계의 질병에 사용할 수 있습니다. 사용 가능한 트리 트 먼 트에 불구 하 고 질병 종종 진행. 따라서, 발견과 새로운 치료 modalities의 개발 고급 질환 전립선 암 환자 치료를 개선 하는 데 필요한 있습니다.
질량 분석 (MS)-펩 티 드 analytes4의 수천 수백의 검색을 통해 proteome의 글로벌 분석을 제공 하는 기반된 접근. 특히, 식별 및 펩 티 드4,5의 수천의 정량 발견 proteomics로 알려진 또한 데이터 종속 수집 (DDA), 얻을 수 있습니다. MS 기반의 검색 proteomics 더 내려 proteomics, 그대로 단백질 특징 및 상향식 (로 알려진 또한 샷건) 단백질, 펩 티 드 단백질5의 특성을 분석 하 구분 된 될 수 있습니다. 따라서, 샷건 proteomics에 베이스 단계에서에서 일어난다 단백질 펩 티 드로 다니엘을 선행 하는 MS 분석 샘플 준비. 결국에는 펩 티 드 단백질 확인을 위해 다시 매핑할 수 데이터베이스 검색 수행 됩니다. 레이블 없는 뿐만 아니라 몇몇 동위 원소-라벨 [예를 들어, 안정 동위 원소 세포 배양 (SILAC)에 있는 아미노산에 의해 라벨] 방법은 사용할 수 있습니다 샘플6,7사이 펩 티 드를 양적 비교 하. 동위 원소 라벨 기술 금 동안, 레이블 자유로운 방법 유사한 정량화 정확도8,9 증명 그리고 감도 및 특이성10비교 장단점. 레이블 없는 정량 큰 범위를 제공 하 고 반면 레이블 기반 방법 비용 및 멀티플렉싱 용량6,,78에 의해 제한 됩니다 많은 더 많은 샘플, 사이 비교를 허용.
또한, 샷건 MS가 포스트 번역 상 수정 (PTMs) 인 산화11등도 사용할 수 있습니다. 총 펩 티 드에 비해 phosphopeptides의 더 낮은 화학 량 론 특성, 여러 가지 방법은 항 체 기반 immunoprecipitation phosphotyrosine (pY) 펩 티 드의 이산화 티타늄 (티 오2 포함 하 여 phosphopeptides에 대 한 풍부 하 게 채용 ), 및 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)5,12움직일. 단백질 인 산화 신호 경로, 샷건 phosphoproteomics 유 방13, 전립선14, 신장15를 포함 하 여 다른 암에 변화를 신호 하는 세포를 조사 하는 연구원 수 많은 세포에서 중요 한 단계 이므로 그리고 난소,16,17 암 생물학을 이해 하 고 치료에 대 한 잠재적인 새로운 목표를 식별 하는.
이 레이블 없는 샷건 phosphoproteomic 방법은 Graeber 그룹18,,1920에 의해 건축 하 고 세련 된에 따라 이전 작품 이었다. 이 프로토콜 추출 및 펩 티 드로 단백질 및 조직에서 phosphoproteins의 소화를 설명 함으로써 시작 됩니다. 우리는 다음 세부 평 펩 티 드 항 체 특정 phosphotyrosine 사용 하 여 티 오2의 농축. 우리는 또한 강력한 양이온 교환 (SCX) 뒤에 티 오2를 사용 하 여 phosphoserine/트레오닌 (pST) 펩 티 드의 농축을 설명 합니다. 이 프로토콜은 MS 시설 샘플의 제출 및 확인 하 고 phosphopeptides 및 그들의 해당 phosphoproteins 계량 MS 분석 소프트웨어를 사용 하 여 마칩니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램은 다른 암과 종양 이외의 필드에 전립선 암 넘어 확장할 수 있습니다.
Phosphopeptides에 대 한 풍부 하 게이 프로토콜을 활용 하 여, 전에 실험 디자인의 신중이 중요 합니다. 생물 복제를 사용 하 여 기술 복제 보다 질량 분석 자원의 경제적인 사용이 이다. 필요한 복제 수 부분에 데이터의 변화에 따라 달라 집니다. 최근 연구, 식별 수 증가 간신히 3 넘어 복제의 수를 증가 하는 동안 더 많은 그룹 증가 사이 중요 한 식별 번호10복제 증명.
셀에 phosphoproteins의 더 낮은 풍부 때문 충분 한 시작 단백질 양을 검색 모드에서 전립선 암 샘플에서 글로벌 phosphoproteome를 얻을 필요가 있습니다. 이 실험에서 단백질의 5 mg이 사용 되었다. 셀의 약 5 거의 confluent 15 cm 요리는 비록이 셀 라인-종속 될 것입니다 충분 한 단백질이이 프로토콜에 대 한 입력으로 제공 합니다. 종양 조직에 관해서는 단백질의 예상된 수익률 조직 무게의 약 6-8%입니다. 체 외에서 환경에서 고려해 야 할 긍정적인 컨트롤 샘플 셀을 수확 하기 전에 30 분 동안 1 m m 바의 추가 이다. 바, 경쟁력 있는 단백질 phosphotyrosyl 인산 가수분해 효소 억제 물, pY 펩 티 드 식별29의 수를 증가 하는 따라서 티로신 인 산화를 유지 됩니다.
깨끗 한 소화 phosphopeptide 식별을 극대화 하기 위해 중요 한 단계 이다. Coomassie 얼룩 테스트 외에도 데이터에서 누락된 분열의 % 소화 효율 (그림 2)를 평가 하 사용할 수 있습니다. 품질 관리 소프트웨어는 사용할 수 있는 놓친된 분열 및 MS 데이터 품질30를 평가 하기 위해 다른 통계 분석. Trypsin은 가장 일반적인, 다른 프로 테아 제를 사용할 수 있습니다 하는 동안 주소 범위 격차는 프로테옴 최적의 tryptic 펩 티 드 수 없습니다5 31생성. MS 분석 소프트웨어의 설정 다음 프로 테아 제에 변화 조정에 따라 수정 해야 합니다.
프로토콜 (pY 농축)에 대 한 immunoprecipitation를 사용 하 여 phosphopeptides에 대 한 풍부 하 게 이산화 티타늄 (티 오2) 뿐만 아니라. 펩 티 드에 대 한 풍부 하 게 대체 방법이 포함 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 금속 산화물 친화성 크로마토그래피 (MOAC) 수산화 알루미늄 등 금속 이온 폴리머 기반 선호도 캡처 (PolyMAC) 에 대 한 다른 금속 산화물 5,12. 이전 연구 결과 다른 농축 방법 phosphopeptides32의 다른 인구에 대 한 풍부 하 게 나타났습니다. 예를 들어, IMAC MOAC 선호 모노 phosphorylated 펩 티 드33풍요롭게 하는 동안 더 많은 멀티 phosphorylated 펩 티 드를 풍요롭게. 이 프로토콜의 대표 결과 반영이 관찰 (그림 4B). 최근 게시는 아이맥과 MOAC 하이브리드 소재를 사용 하 여 잠재적으로 제공할 수 phosphopeptide 종34의 더 큰 범위를 시연 했다. 따라서,이 프로토콜 훨씬 더 포괄적인 phosphoproteomic 분석에 대 한 허용 하는 동시에 다른 농축 방법을 활용 하 수정 될 수 있습니다.
MaxQuant26 소프트웨어 제품군은이 프로토콜에서 MS 데이터를 분석 하는 데 사용 됩니다 하지만 상용 응용35 phosphopeptide 식별 및 정량화에 대 한 사용할 수 있습니다. Phosphopeptide 식별에 대 한 지역화 가능성 차단 적용 됩니다. 이 필터는 phosphoresidue 식별10,28에서 높은 신뢰를 (즉, 0.75 보다 큰)와 phosphopeptides에 대 한 선택 하려면 수행 됩니다. 즉, 인 그룹에 포함 될 수 있는 다른 모든 잔류물의 총계 확률 0.25 보다 작습니다. 이 구분 phosphopeptide 선택의 엄중을 증가 하기 위하여 올려질 수 있습니다. 식별 번호에 관한 평 펩 티 드의 예상된 번호는 수백에 높은 수천에 pST 펩 티 드의 예상된 번호는입니다. 이 값에 약 2%, 12%와 86%는 phosphosites의 있는 평, pT, 및 pS, 각각28이전 관찰된 phosphoproteome 배포 반영.
병렬로 평 및 pST 농축 단계를 수행 하는 경우 6 일에서 프로토콜에 샘플 준비 단계를 완료할 수 있습니다. MS의 강력한 도구와 함께 함으로써,이 같은 phosphopeptide 농축 프로토콜 그들의 각 연구 분야에 phosphoproteome를 분석 하는 데이터를 수집 하는 과학자를 위한 글로벌 접근 방식을 제공 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리가 원고에 조언과 입력을 제공 하기 위한 드레이 크 연구소의 회원을 감사 합니다. 우리는 또한 조언을 제공 하 고 우리의 샘플에 질량 분석을 수행할 생물 질량 분석 시설의 로버트 우드 존슨 의과대학과는 주립 대학 뉴저지의 럿 거 스의 회원을 감사 합니다. 래리 C. 쳉에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 보너스 번호 T32 GM008339에서 국립 보건원의 지원 됩니다. 토마스 G. Graeber NCI/NIH (포자 전립선 암 P50 CA092131;에 의해 지원 됩니다. P01 CA168585)와 미국 암 사회 연구 학술 상 (RSG-12-257-01-TBE). 저스틴 M. 드레이크는 부의 방어 전립선 암 연구 프로그램 W81XWH-15-1-0236, 전립선 암 재단 영 조사 상, 뉴저지 건강 재단, 그리고는 Rutgers에서 정밀 의학 이니셔티브 파일럿 수상에 의해 지원 됩니다. 뉴저지 암 연구소입니다.
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |