Ce protocole décrit un procédé pour extraire et enrichir des phosphopeptides de lignées cellulaires de cancer de la prostate ou de tissus pour une analyse de la phosphoproteome via basé sur la spectrométrie de masse protéomique.
Phosphoprotéomique implique l’étude à grande échelle des protéines phosphorylées. La phosphorylation des protéines est une étape critique dans nombreuses voies de transduction de signal et est étroitement contrôlée par les kinases et phosphatases. Par conséquent, caractérisant le phosphoproteome peut donner un aperçu identifier de nouvelles cibles et biomarqueurs pour la thérapie oncologique. Spectrométrie de masse permet globalement détecter et quantifier des milliers d’événements uniques de phosphorylation. Cependant, phosphopeptides sont beaucoup moins abondants que les non-phosphopeptides, faire une analyse biochimique plus difficile. Pour contourner cette limitation, les méthodes d’enrichissement des phosphopeptides avant l’analyse de spectrométrie de masse sont nécessaires. Nous décrivons une procédure pour extraire et de digérer les protéines du tissu pour produire des peptides, suivies d’un enrichissement de la phosphotyrosine (pY) et de peptides phosphosérine/thréonine (pST) en utilisant une base d’anticorps et/ou de dioxyde de titane (TiO2)-base méthode d’enrichissement. Après la préparation de l’échantillon et la spectrométrie de masse, nous a par la suite identifier et quantifier des phosphopeptides utilisant la spectrométrie de masse-chromatographie en phase liquide et logiciel d’analyse.
Environ 165 000 nouveaux cas et environ 29 000 décès aura lieu en 2018 en raison du cancer de la prostate, ce qui représente le cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès liés au cancer chez les hommes dans les États-Unis1. Premiers stades du cancer de la prostate sont traitables avec résection ou rayonnement thérapie de maladie orgue confiné, où le taux de récurrence de dix ans est entre 20 % et 40 % pour les patients qui subissent une prostatectomie et entre 30 % et 50 % pour les patients qui reçoivent le rayonnement 2de thérapie. Parce que le cancer de la prostate repose sur des androgènes de signalisation pour la croissance, des thérapies de castration chirurgicale et chimiques sont également employées pour les patients à haut risque. Cependant, rechute se produit lorsque le cancer ne répond plus au traitement de privation androgénique comme en témoigne la récidive biochimique, où renaît l’antigène prostatique spécifique dans le sérum. À ce stade dans la progression, les métastases sont souvent détectés ainsi. Ce stade avancé, appelé cancer de la prostate métastatique résistant à la castration, représente la forme mortelle de la maladie où le pronostic est une durée médiane de survie inférieure à deux ans3. Il existe peu d’options thérapeutiques dans la maladie de stades, y compris la seconde génération anti-androgènes tels qu’enzalutamide et abiratérone, ainsi que de chimiothérapie à base de taxane comme docetaxel. Malgré les traitements disponibles, la maladie évolue souvent. Par conséquent, la découverte et le développement de nouveaux traitements sont nécessaires pour améliorer les soins des patients de cancer de la prostate avec une maladie avancée.
Spectrométrie de masse (MS)-selon les approches offrent une analyse globale du protéome grâce à la détection des centaines de milliers de peptide analytes4. En particulier, protéomique de découverte, une acquisition de données dépendantes (DDA), également connu sous le nom peut permettre l’identification et la quantification des milliers de peptides4,5. Protéomique axée sur le MS découverte peut être délimité davantage en protéomique haut vers le bas, où les protéines intactes sont caractérisés, et protéomique (également connu sous le nom de fusil) de bas en haut, où les peptides sont analysées afin de caractériser les protéines5. Ainsi, en protéomique de fusil de chasse, une étape de protéolyse se déroule dans la préparation de l’échantillon qui précède l’analyse MS en conjonction avec les protéines en peptides. À la fin, une recherche de base de données est exécutée pour remapper les peptides à des protéines pour l’identification. Label-free, ainsi que plusieurs isotopes-étiquetage [p. ex., isotope stable étiquetant par des acides aminés dans la culture de cellules (SILAC)] méthodes peuvent être utilisées pour comparer quantitativement les peptides entre échantillons6,7. Alors que les techniques de marquage isotopique sont l’étalon-or, exempte d’étiquette méthodes ont démontré similaires quantification exactitudes8,9 et ont compromis comparables entre la sensibilité et la spécificité de10. Quantification exempte d’étiquette fournit une plus grande couverture et permet des comparaisons entre les échantillons plus nombreux, alors que les méthodes basées sur les étiquettes sont limités par les coûts et multiplexage capacités6,7,8.
En outre, fusil MS peut être aussi utilisé pour interroger les modifications post-traductionnelles (PTMs) tel que la phosphorylation11. En raison de la nature inférieure stoechiométrique des phosphopeptides par rapport aux peptides totales, plusieurs méthodes sont utilisées pour enrichir des phosphopeptides, y compris à base d’anticorps immunoprécipitation des peptides de la phosphotyrosine (pY), dioxyde de titane (TiO2 ) et immobilisée en métal affinité chromatographie (IMAC)5,12. Parce que la phosphorylation des protéines est une étape clé dans plusieurs cell signaling pathways, fusil de chasse phosphoprotéomique permet aux chercheurs d’étudier les changements dans les différents cancers, notamment du sein13, la prostate14, rénale15, de la signalisation cellulaire et ovarien,16,17 afin de mieux comprendre la biologie du cancer et d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour la thérapie.
Cette méthode de phosphoproteomic exempte d’étiquette de fusil de chasse a été construit et raffinée basée sur les travaux antérieurs de le Graeber groupe18,19,20. Ce protocole commence par décrire l’extraction et la digestion des protéines et des phosphoprotéines du tissu en peptides. Ensuite, nous détaillons l’enrichissement de pY peptides utilisant des anticorps spécifiques phosphotyrosine et TiO2. Nous décrivons également l’enrichissement des peptides phosphosérine/thréonine (pST) à l’aide de forte échangeuse de cations (SCX) suivie de TiO2. Ce protocole se termine par la présentation des échantillons à un laboratoire de MS et l’utilisation du logiciel d’analyse de MS pour identifier et quantifier des phosphopeptides et leurs phosphoprotéines correspondantes. L’application du présent protocole peut s’étendre au-delà de la prostate dans d’autres cancers et les champs en dehors de l’oncologie.
Avant d’utiliser ce protocole pour enrichir des phosphopeptides, un examen attentif du plan expérimental est critique. À l’aide de réplicats biologiques est une utilisation plus rentable des ressources de la spectrométrie de masse que les répétitions techniques. Le nombre de répétitions nécessaires dépendra en partie de la variabilité des données. Une étude récente a démontré que, tout en augmentant le nombre de répétitions en sus de la troisième que marginalement augmente le nombre d’identifications, le nombre d’identification significative entre groupes augmente plus réplique10.
En raison de la plus faible abondance des phosphoprotéines dans la cellule, une quantité suffisante de protéine départ est nécessaire pour obtenir un phosphoproteome global des échantillons de cancer de la prostate en mode découverte. Dans ces expériences, 5 mg de protéine a été utilisé. Environ cinq plats de 15 cm presque confluentes de cellules fournissent suffisamment de protéines comme entrée dans ce protocole, bien qu’il s’agit de cellule dépendante de ligne. En ce qui concerne le tissu tumoral, le rendement de protéine est environ 6 à 8 % du poids du tissu. Dans le milieu in vitro , un échantillon de contrôle positif à considérer est l’ajout de vanadate de 1 mM pour 30 min avant la récolte des cellules. Vanadate, un inhibiteur de la phosphatase concurrentiel protéine phosphotyrosyl, préservera la phosphorylation de la tyrosine, augmentant ainsi le nombre de pY peptide identifications29.
La digestion propre est une étape clé pour optimiser l’identification phosphopeptide. En plus de l’essai de tache de bleu de Coomassie, le pourcentage des clivages manquées dans les données peut servir à évaluer l’efficacité de la digestion (Figure 2). Logiciel de contrôle de qualité est disponible qui analyse les clivages manquées et autres mesures pour évaluer les données de MS qualité30. Alors que la trypsine est que les plus courantes, d’autres protéases sont disponibles5 pour combler les lacunes couverture dans le protéome où des peptides tryptiques optimales ne peut pas être généré31. Les paramètres du logiciel d’analyse MS devra alors être modifiée en conséquence pour s’ajuster à des changements dans les protéases.
Le protocole utilise immunoprécipitation (pour l’enrichissement de pY) ainsi que le dioxyde de titane (TiO2) afin d’enrichir des phosphopeptides. Les approches alternatives pour enrichir des peptides incluent chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC), autres oxydes métalliques pour la chromatographie d’affinité métallique (MOAC) tels que l’hydroxyde d’aluminium et de capture d’affinité d’ion métallique à base de polymères (PolyMAC) 5,,12. Des études antérieures ont montré que les méthodes d’enrichissement différents enrichissent pour différentes populations des phosphopeptides32. Par exemple, IMAC enrichit plusieurs peptides phosphorylés multi tandis que MOAC préférence enrichit de peptides phosphorylés mono33. Les Résultats de représentant du présent protocole reflètent cette observation (Figure 4 b). Une publication récente a démontré que combinant IMAC et Mac en utilisant un matériau hybride pourrait fournir éventuellement une plus grande couverture de phosphopeptide espèces34. Ainsi, le présent protocole peut être modifié pour utiliser d’autres méthodes d’enrichissement en parallèle pour permettre des analyses phosphoproteomic encore plus complètes.
La suite logicielle de MaxQuant26 est utilisée pour analyser les données de MS dans le présent protocole, mais les applications commerciales35 sont également disponibles pour la quantification et identification de phosphopeptide. Pour l’identification de phosphopeptide, une probabilité de localisation coupure est appliquée. Ce filtre est effectué pour sélectionner des phosphopeptides avec un degré de confiance élevé (c’est-à-diresupérieur à 0.75) l’identification de phosphoresidue10,28. En d’autres termes, la probabilité cumulée de tous les autres résidus qui pourraient contenir le phospho-groupe est inférieure à 0,25. Ce seuil de décision pourrait être augmenté afin d’accroître la rigueur de la sélection de phosphopeptide. En ce qui concerne le nombre d’identifications, le nombre de peptides de pY est dans les centaines, tandis que le nombre de peptides pST est dans les milliers de hauts. Ces valeurs reflètent déjà observée phosphoproteome distribution où environ 2 %, 12 % et 86 % de la phosphosites sont pY, pT et pS, respectivement28.
Si les étapes d’enrichissement pY et la TVP sont exécutés en parallèle, les étapes de préparation d’échantillon dans le protocole peuvent être complétées en six jours. En s’associant avec le puissant outil de MS, protocoles d’enrichissement phosphopeptide comme celui-ci offrent une approche globale pour les scientifiques recueillir des données pour analyser le phosphoproteome dans leurs domaines respectifs.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres du laboratoire de Drake pour fournir des conseils et des commentaires sur le manuscrit. Nous remercions également les membres du biologique masse spectrométrie installation de Robert Wood Johnson Medical School et Rutgers, The State University of New Jersey, pour donner des conseils et exécution de spectrométrie de masse sur nos échantillons. Larry C. Cheng est pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le numéro prix T32 GM008339. Thomas G. Graeber est pris en charge par le NCI/NIH (des spores dans le Cancer de la Prostate P50 CA092131 ; P01 CA168585) et l’American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake est pris en charge par le ministère de la défense Prostate Cancer recherche programme W81XWH-15-1-0236, Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, la Fondation de santé du New Jersey et une précision médecine Initiative pilote Award de la Rutgers Cancer Institute du New Jersey.
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |