在这里, 我们提出了一种新的方法来识别植物病毒的双链 DNA 基因组。我们使用标准方法从受感染的树叶中提取 DNA 和 RNA, 并进行下一代测序。生物信息学工具将序列组合成重叠, 确定重叠代表病毒基因组并将基因组分配给分类组。
这种 metagenome 方法是用来识别植物病毒与循环 DNA 基因组及其转录。通常植物 DNA 病毒发生在他们的宿主低效度或不能被机械接种到另一宿主是很难传播, 以达到更大的感染性物质的价。受感染的叶子是地面在一个温和的缓冲与最佳的 pH 值和离子组成建议净化大多数杆状对逆转录。尿素被用来分解病毒和溶解细胞成分的包涵体。差速离心提供了病毒与植物污染物的进一步分离。蛋白酶 K 处理去除衣壳。然后将病毒 DNA 浓缩并用于下一代测序。重叠数据用于装配提交给 NCBI BLASTn 的信息, 以确定生成的数据集中的病毒序列的子集。在平行管道中, rna 是用标准的基于柱的 rna 提取方法从受感染的树叶中分离出来的。然后核糖体损耗被进行, 以丰富的一个子集的 mRNA 和病毒转录。从 rna 测序 (rna 序列) 中提取的组合序列被提交到 NCBI-BLASTn, 以确定此数据集中病毒序列的子集。在我们的研究中, 我们发现两个相关的全长 badnavirus 基因组在两个数据集。这种方法更倾向于另一种常用的方法, 即提取小 RNA 序列的总种群来重建植物病毒基因组序列。这后宏基因组管道恢复与病毒相关的序列, 是复古转录元素插入到植物基因组。这是结合生物化学或分子化验, 以进一步辨别积极的传染性药物。本研究中记录的方法, 恢复序列代表复制病毒可能表明有源性病毒感染。
新兴的植物病害驱使研究人员开发新的工具来识别正确的因果剂。初次报告新的或复发的病毒疾病是基于常见的症状, 如马赛克和畸形的叶子, 静脉清除, 侏儒症, 枯萎, 病变, 坏死, 或其他症状。报告一种新病毒作为一种疾病的致病剂的标准是将其与其他污染病原体分离, 并将其传播到适当的宿主中, 并通过对原寄主物种的健康植物进行接种而重现这种疾病。这种方法的局限性是, 植物病毒的许多属依赖于昆虫或其他传播到合适寄主或返回原寄主物种的媒介。在这种情况下, 寻找合适的向量可以延长, 可能会有困难, 建立实验室殖民地的载体, 并进一步努力, 以制定一个实验性传输协议。如果不能取得成功的实验室传输研究的条件, 那么这项工作就没有达到报告新病毒病的标准。对于在其自然宿主中发生的病毒的低效度, 研究人员必须确定可供传播的替代宿主, 以维持足够的传染性种群进行研究。对于只感染少数植物的病毒物种, 这也可能成为增长的种群文化的障碍1。
近年来, 科学家们更经常使用高通量的宏基因组方法来发现环境中存在的病毒序列, 这可能与已知疾病无关, 但可以分配给分类物种和属。2,3,4. 这种在不同环境中发现和分类遗传物质的方法为描述自然界中的病毒多样性或它们在某种生态系统中的存在提供了一种方法, 但并不一定能证实一个框架, 可以确定一种明显疾病的致病因子。
Badnavirus属属 pararetroviruses 的家族Caulimoviridae 。这些病毒是杆状的形状与圆形双链 DNA 基因组约7至 9 kb。所有 pararetroviruses 通过 RNA 中间体复制。Pararetroviruses 存在作为 episomes 和复制独立植物染色体脱氧核糖核酸5,6。对病毒种群的田间研究表明, 这些病毒种群是遗传复杂的。此外, 通过高通量测序在一系列植物基因组中获得的信息揭示了许多 badnavirus 基因组片段被非法整合事件插入植物基因组的例子。这些内源 badnavirus 序列不一定与感染7、8、9、10、11相关。随后, 利用 episomal 基因组的亚群多样性以及内源序列12、13的发生, 将新的 badnaviruses 作为疾病的致病动因来识别。
虽然没有一个最佳的管道, 以发现新的 pararetrovirus 基因组, 有两种常见的方法, 以确定这些病毒作为致病剂的疾病。一种方法是丰富的小 RNA 序列从受感染的叶子, 然后组装这些序列, 以重建病毒基因组 (s)14,15,16,17。另一种方法是滚动圈放大 (RCA) 放大循环 DNA 病毒基因组18。RCA 的成功取决于叶子的年龄和病毒在选定的组织中的效价。RCA 产品受到限制消化和克隆成质粒, 直接测序19,20,21。
美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV) 是一种 badnavirus, 被描述为在美人蕉黄斑驳病的病因, 虽然只有565的 bp 片段的基因组以前被隔离感染 cannas22。一项当代研究发现 CaYMV purpurata (开花姜;CaYMV-美联社)23。本研究的目的是从受感染的芭蕉百合中恢复完整的 badnavirus 基因组序列。我们描述了一种从植物污染物中纯化病毒的协议, 然后将病毒 dna 从这一制备中分离出来, 并准备一个 DNA 库以供使用。这种方法消除了中间分子放大步骤的需要。我们还从受感染植物中分离出 rna-后向的基因, 其中包括 rna 序列, 使用每种核酸制剂进行。组装重叠被发现与Badnavirus分类在两个数据集使用国家生物技术和信息中心 (NCBI) 基本的本地对齐搜索工具核酸 (BLASTn)。我们确定了两个 badnavirus 物种的基因组24。
近年来, 在自然环境中研究植物病毒的生物多样性, 包括丰富的病毒样粒子 (vip) 或病毒特异 RNA 或 DNA2,3,44, 已采用多种方法, 45,46 。这些方法其次是生物信息学分析。本研究的目的是寻找一种常见疾病的致病剂在栽培植物。据报道, 这种疾病是一种未知病毒的结果, 它具有非封闭的杆状粒子, 并且只有565的 bp 片段被克隆了47。这些信息足以让先前的研究人员假设将病毒分配给家庭Caulimoviridae中的Badnavirus属。虽然先前的报告假设, 芭蕉百合的美人蕉斑驳病是单一 badnavirus 的结果, 使用本研究概述的 metagenomics 方法, 我们确定这一疾病是由两个暂定 badnavirus 物种24。因此, 使用 metagenome 方法来发现一种疾病的因果动因的力量是, 我们现在可以确定可能有不止一个原因的情况。
我们的方法结合 DNA 和 RNA 测序数据是彻底的, 并表明, 使用两种方法的结果产生了一致的结果, 并确认存在两个相关的病毒。我们使用了一个改良的程序, 以隔离 caulimoviruses, 并产生了一个样本, 丰富的病毒相关的核酸, 并在病毒衣壳内保护。承包了一个服务实验室进行 DNA 测序。在 dna 合成的时序周期中, dna 聚合酶将荧光标记的核苷酸纳入 dna 模板链中, 这是从头测序的基本概念。组装后的重叠被提交到一个生物信息学工作流中, 产生了几个重叠, 被确定为病毒重叠。通过对 ribo 的 rna 制剂的 rna 序列数据的生物信息学分析, 得到了两种病毒基因组10、24、48、49、50的进一步确认。一个有趣的结果是了解到, DNA 和 RNA 序列恢复的序列的数量提供了类似的非病毒和病毒核酸分布。对于 DNA 和 RNA 序列, < 0.5% 序列是病毒起源。在病毒序列的人口之内78-82% 属于家庭Caulimoviridae。通过将组装后的病毒重叠与 DNA 和 RNA 测序进行比较, 证实了两种组装的基因组均发生在两个数据集中。
一个只使用 DNA 测序来识别新病毒基因组的关注是 badnavirus 基因组是一个开放的循环 DNA。我们推测, 序列重叠的不连续性在基因组可能会阻碍基因组组装从重叠。对 DNA 测序结果的初步检验发现两种相似的病毒基因组。我们假设这些基因组要么代表了一个尚未研究的物种的遗传多样性, 要么代表了两个物种共同感染同一植物24。因此, 对 DNA 和 RNA 测序所获得的数据集进行的集体生物信息学分析, 能够证实两个全长基因组的存在。
还有另一份报告提出了一种从植物组织匀浆中提取 vip 和核酸的替代方法, 用于宏基因组研究, 其基础是从花椰菜镶嵌病毒(CaMV; caulimovirus) 中恢复 DNA 的程序.3。该方法确定了非栽培植物中新的 RNA 和 DNA 病毒序列。这项研究中所使用的 caulimovirus 隔离程序的步骤, 以发现一种栽培植物病害的致病剂, 不同于从自然感染植物中提取 vip 的步骤24。两种改进方法的成功表明, caulimovirus 隔离的框架程序可能是宏基因组研究一般植物病毒的一个重要起点。
The authors have nothing to disclose.
研究由俄克拉荷马州科技进步中心应用研究计划第二阶段 AR 132-053-2 资助;并由俄克拉荷马州农业部特种作物研究补助金项目。我们感谢鸿锦博士和一所由 NSF (EOS-0132534) 和 NIH (2P20RR016478-04、1P20RR16478-02 和 5P20RR15564-03) 赠款支持的俄勒冈州立的生物信息学核心设施。
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
Primer 3.0 | Simgene.com | ||
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |