وهنا يقدم نهجاً جديداً للتعرف على الفيروسات النباتية مع مورثات الحمض النووي المزدوج-حبلا. نحن نستخدم الطرق القياسية لاستخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأوراق المصابة وإجراء تسلسل الجيل القادم. أدوات Bioinformatic تجميع تسلسل في كونتيجس، وتحديد كونتيجس يمثلون جينوم الفيروس وتعيين الجينوم للمجموعات التصنيفية.
يتم استخدام هذا النهج ميتاجينومي للتعرف على الفيروسات النباتية مع التعميم الحمض النووي الجينوم وتلك النصوص. ويصعب غالباً فيروسات الحمض النووي النباتية التي تحدث في انخفاض التتر في المضيفة لهم، أو لا يمكن تلقيح ميكانيكيا لمضيف آخر للنشر إلى تحقيق من عيار أكبر من المواد المعدية. الأوراق المصابة هي أرض الواقع في منطقة عازلة خفيفة مع الرقم الهيدروجيني الأمثل والأيونية تكوين الموصى بها لتنقية معظم الفيروسات التراجعية في الفقرة باسيليفورم. يتم استخدام اليوريا إلى تفريق إدراج الهيئات التي اعتراض فيريونس وحل المكونات الخلوية. الطرد المركزي التفاضلي توفر مزيدا من فصل فيريونس عن الملوثات النبات. ثم يزيل العلاج بروتيناز ك كابسيدس. ثم ركزت الحمض النووي الفيروسي واستخدامها للجيل التالي التسلسل (خ ع). وتستخدم البيانات خ ع لتجميع كونتيجس التي تقدم إلى نكبي-بلاستن لتحديد مجموعة فرعية تسلسل الفيروس في مجموعة البيانات الذي تم إنشاؤه. في خط مواز، الجيش الملكي النيبالي معزول من يترك المصاب باستخدام أسلوب استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى عمود قياسي. ثم يجري استنفاد الريبوسوم لإثراء لمجموعة فرعية نصوص مرناً والفيروسات. تجميع تسلسل المستمدة من الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) قدمت إلى نكبي-بلاستن لتحديد مجموعة فرعية تسلسل الفيروس في dataset هذه. وفي دراستنا، حددنا الجينوم بادنافيروس كامل طول يتصل اثنان في مجموعات البيانات اثنين. هذا الأسلوب المفضل لنهج مشترك آخر الذي يستخرج السكان الكلي لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة إعادة تشكيل الفيروس مصنع تسلسل الجينوم. هذا الفيروس يستعيد خط أنابيب الجينومية الأخيرة المتعلقة بتسلسل أن يتم إدراج العناصر الرجعية تدوين في جينوم النبات. ويقترن هذا بفحوصات الكيمياء الحيوية أو الجزيئية زيادة تمييز العوامل المعدية بنشاط. النهج الموثقة في هذه الدراسة، يسترد متواليات الممثل تكرار الفيروسات التي يرجح أن تشير إلى الإصابة بعدوى الفيروس النشط.
أمراض النباتات الناشئة محرك الباحثين لتطوير أدوات جديدة للتعرف السببية الصحيحة (المحليون). تستند التقارير الأولية من الأمراض الفيروسية الجديدة أو المتكررة على الأعراض التي تحدث عادة مثل الفسيفساء والتشوهات ليف، الوريد مسح، والتقزم، ذبول، والآفات، نخر، أو أعراض أخرى. القياسية للإبلاغ عن ظهور فيروس جديد كما وكيل المسببة لمرض فصله من مسببات الأمراض تلويث أخرى، نشر في مناسبة المضيف، واستنساخ هذا المرض بتطعيم في منشآت صحية من الأنواع المضيف الأصلي. القيد في هذا النهج أن أجناس العديد من الفيروسات النباتية تعتمد على الحشرات أو ناقلات أخرى لانتقال العدوى إلى مضيف مناسب أو العودة إلى الأنواع المضيف الأصلي. في هذه الحالة، يمكن أن يطول البحث عن ناقلات مناسبة، قد تكون هناك صعوبات إقامة المستعمرات مختبر مكافحة ناقلات، وتبذل المزيد من الجهود اللازمة لوضع بروتوكول للبث التجريبي. وإذا تعذر تحقيق الشروط اللازمة للدراسات المختبرية نجاح الإرسال، ثم العمل يقصر عن المعيار للإبلاغ عن مرض فيروس جديد. للبحث عن الفيروسات التي تحدث في مضيفيهم الطبيعية في التتر منخفضة جداً، يجب تحديد الباحثين المضيفين البديلة للنشر للحفاظ على مخزونات المعدية كافية لإجراء البحوث. أنواع الفيروسات التي تصيب النباتات قليلة فقط وهذا يمكن أيضا عائقا لنمو الثقافات الأسهم1.
في السنوات الأخيرة، هي أكثر في كثير من الأحيان أن توظيف العلماء خ ع الفائق والنهج الجينومية للكشف عن تسلسل الفيروس الموجودة في البيئة، والتي قد تكون موجودة لا علاقة لها بمرض معروف، ولكن يمكن تعيينها إلى الأنواع التصنيفية وأجناس 2 , 3 , 4-هذه النهج لاكتشاف وتصنيف المواد الجينية في بيئة متميزة توفر طريقة لوصف تنوع الفيروسات بطبيعتها أو وجودها في نظام إيكولوجي معين ولكن لا تؤكد بالضرورة إلى وضع إطار لتحديد العوامل السببية لمرض الظاهر.
جنس بادنافيروس ينتمي إلى عائلة كوليموفيريداي باراريتروفيروسيس. هذه الفيروسات باسيليفورم في الشكل مع جينوم الحمض النووي حبلا مزدوجة دائرية من 7 إلى 9 كيلو بايت تقريبا. باراريتروفيروسيس جميع النسخ المتماثل من خلال وسيط الجيش الملكي النيبالي. باراريتروفيروسيس قائمة بوصفها ابيسوميس، وتكرار مستقلة من النباتات الصبغية الحمض النووي5،6. دراسات ميدانية للفيروس السكان تشير إلى أن هؤلاء السكان فيروس وراثيا المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت معلومات تم الحصول عليها عبر مجموعة من جينوم النبات بتسلسل الإنتاجية العالية أمثلة عديدة من أجزاء الجينوم بادنافيروس إدراجها بأحداث التكامل غير شرعي في جينومات النباتات. هذه التسلسلات بادنافيروس الذاتية لا ترتبط بالضرورة بالعدوى7،،من89،،من1011. وفي وقت لاحق، استخدام خ ع لتحديد بادنافيروسيس الجديد كعامل سببية المرض يعقدها يتدنى تنوع الجينوم ابيسومال، فضلا عن حدوث تسلسل الذاتية12،13.
أن هناك لا أحد أنابيب الأمثل لاكتشاف الجينوم باراريتروفيروس الرواية، فهناك نهجان مشتركة لتحديد هذه الفيروسات كالعوامل المسببة للمرض. أسلوب واحد هو إثراء لتسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة من الأوراق المصابة وثم تجميع هذه التسلسلات إعادة تشكيل الفيروس genome(s)14،15،،من1617. وثمة نهج آخر هو التضخيم دائرة المتداول (RCA) لتضخيم جينومات الفيروس الحمض النووي الدائري18. يتوقف نجاح RCA سن الورقة وعيار الفيروس في الأنسجة المختارة. المنتجات RCA تخضع لقيود الهضم والمستنسخة في والبلازميدات لمباشرة تسلسل19،،من2021.
فيروس رقش أصفر القنا هو بادنافيروس (كايمف) ويوصف بأنه قضية المسببة للمرض رقش أصفر في القنا، على الرغم من أن جزء bp 565 الجينوم فقط تم عزل سابقا من المصابين كاناس22. حددت دراسة معاصرة كايمف في بوربوراتا خولنجان (الزنجبيل المزهرة؛ كايمفاب)23. وكان الهدف من هذه الدراسة لاسترداد تسلسل الجينوم بادنافيروس كاملة من الزنابق القنا المصابة. نحن وصف بروتوكول لتنقية الفيروس من النبات الملوثات، وثم عزل الحمض النووي الفيروسي من هذا الإعداد، وإعداد مكتبة الحمض النووي لاستخدامها في فئة الخدمات العامة الوطنية. وهذا النهج يلغي الحاجة للخطوات الوسيطة التضخيم الجزيئية. ونحن أيضا عزل مرناً من النباتات المصابة خ ع ما يليها الجيش الملكي النيبالي، الذي يتضمن تسلسل الحمض النووي الريبي أجريت باستخدام كل إعداد الحمض النووي. تم العثور على كونتيجس المجمعة تتصل أصنوفة بادنافيروس في كل مجموعات البيانات باستخدام المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية والمعلومات (نكبي) أداة البحث الأساسية المحلية المحاذاة للأحماض النووية (بلاستن). وقد حددنا الجينوم بادنافيروس اثنين الأنواع24.
وقد استخدمت في السنوات الأخيرة مجموعة متنوعة من أساليب لدراسة التنوع البيولوجي الفيروسات النباتية في البيئات الطبيعية التي تشمل إثراء لجسيمات شبيهة بالفيروس (عزام) أو فيروس محدد الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي2،3،44، 45،46 . وتتبع هذه الأساليب تحليل خ ع وبيوينفورماتيك. وكان الهدف من هذه الدراسة للبحث عن عامل المسببة لمرض شائع في النباتات مزروعة. أبلغ هذا المرض نتيجة لفيروس غير معروف يحتوي على جسيمات باسيليفورم غير المغلفة، والتي كانت فقط جزء bp 565 المستنسخة47. هذه المعلومات غير كافية للباحثين السابقة لتعيين الفيروس نظرياً إلى جنس بادنافيروس داخل الأسرة كوليموفيريداي. في حين أن التقارير السابقة عن الافتراض بأن المرض رقش القنا في الزنابق القنا هو نتيجة بادنافيروس واحد، باستخدام النهج metagenomics المبينة في هذه الدراسة، عقدنا العزم أن المرض سببه بادنافيروس مؤقت اثنين الأنواع24. وهكذا، قوة استخدام نهج ميتاجينومي لاكتشاف عامل المسببة للمرض أنه يمكننا الآن تحديد الحالات حيث قد يكون هناك سبب واحد أو أكثر.
لدينا نهج الجمع بين بيانات تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي دقيق ويوضح أيضا أن النتائج باستخدام نهجين أسفرت عن نتائج متسقة، وأكدت وجود اثنين من الفيروسات ذات الصلة. ونحن العاملين إجراء تعديل لعزل كوليموفيروسيس وأنتجت عينة التي تم إثراء للأحماض النووية المرتبطة الفيروس والتي كانت محمية داخل قفيصه الفيروس. وتم التعاقد مع مختبر خدمة الاضطلاع بتسلسل الحمض النووي. مفهوم أساسي لتسلسل حيثياته بوليميراز الدنا أن يدمج الفلورسنت المسمى النيوكليوتيدات في حبلا قالب الحمض النووي خلال دورات متتالية لتركيب الدنا. كونتيجس تجميعها اتباع طريق خ ع قدمت في سير عمل بيوينفورماتيك المنتجة لعدد قليل من كونتيجس التي تم تحديدها كفيروس كونتيجس. تم الحصول على تأكيد آخر للفيروسات اثنين جينومات10،24،،من4849،50 من خلال تحليل الحمض النووي الريبي seq البيانات المتحصل عليها من استعدادات الجيش الملكي النيبالي المنضب ريبو bioinformatic. وقدمت إحدى نتائج مثيرة للاهتمام أن تعلم أن السكان في تسلسل المستردة بتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي توزيعات مماثلة من الأحماض النووية غير الفيروسية والفيروسية. لتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، كانت < 0.5% من تسلسل الفيروس الأصلي. ضمن السكان فيروس متواليات 78-82% تنتمي إلى أسرة كوليموفيريداي. بمقارنة كونتيجس الفيروسات المجتمعة من تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، أكدنا أن الجينوم المجتمعون اثنين وقعت في مجموعات البيانات على حد سواء.
مصدر قلق لاستخدام تسلسل الحمض النووي فقط لتحديد جينومات الفيروس الجديد هو أن الجينوم بادنافيروس الحمض النووي دائري مفتوح. ونحن من يظن أن متواليات متداخلة ثغرات في الجينوم قد تشكل عقبات للجينوم للجمعية من كونتيجس. وكشفت دراسة أولية لنتائج تسلسل الحمض النووي هما جينوم الفيروس مماثلة. افترضنا أن الجينوم هذه تمثل أما التنوع الوراثي للأنواع التي لم تدرس، أو تمثل نوعين من أنواع المشترك إصابة نفس المصنع24. ولذلك، تمكين تحليل bioinformatic الجماعي لمجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من “خ ع الحمض النووي” والجيش الملكي النيبالي التسلسل، تأكيد وجود اثنين كامل طول الجينوم.
وهناك تقرير آخر الذي وضع طريقة بديلة لاستخراج عزام والأحماض النووية من مصنع هوموجيناتيس للدراسات الجينومية، استناداً إلى إجراءات لاسترداد الحمض النووي من فيروس تبرقش القنبيط (كامب؛ كوليموفيروس)3. وحدد هذا النهج رواية الجيش الملكي النيبالي وتسلسلات فيروس الحمض النووي في النباتات غير المزروعة. الخطوات المستمدة من إجراءات العزل كاوليموفيروس المستخدمة في هذه الدراسة لاكتشاف عامل المسببة لمرض نباتات المزروعة عكس خطوات اشتقاق لاستخراج عزام من النباتات المصابة بطبيعة الحال24. نجاح كلا الأسلوبين تعديل يشير إلى أن الإجراء الإطار للعزلة كوليموفيروس قد تكون نقطة انطلاق قيمة الدراسات الجينومية من الفيروسات النباتية بشكل عام.
The authors have nothing to disclose.
وقد مولت البحوث مركز أوكلاهوما “النهوض بالعلوم” والتكنولوجيا تطبيق البحث برنامج المرحلة الثانية ع 132-053-2؛ ووزارة الزراعة تخصص محاصيل أوكلاهوما برنامج المنح البحثية. ونحن نشكر الدكتور هوانغ هونججين ومرفق الأساسية المعلوماتية الحيوية أوسو الذي كان مدعوما من المنح المقدمة من جبهة الخلاص الوطني (ايوس-0132534)، والمعاهد الوطنية للصحة (2P20RR016478-04، 1P20RR16478-02 و 5P20RR15564-03).
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
Primer 3.0 | Simgene.com | ||
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |