Embora muitos insetos da subordem Heteroptera (Insecta: Hemiptera) são venenosa, sua composição de veneno e as funções das suas toxinas de veneno em sua maioria são desconhecidas. Este protocolo descreve métodos para colher heteropteran venenos para mais de caracterização, utilizando a eletroestimulação, assédio e dissecação da glândula.
Heteropteran insetos como barbeiros (Reduviidae) e bugs de água gigante (Belostomatidae) descendem de um ancestral comum de predadores e venenoso, e a maioria dos heteropterans existentes manter esta estratégia trófica. Alguns heteropterans ter transferida para alimentando-se de sangue de vertebrados (como os kissing bugs, triatomíneos; e percevejos, Cimicidae) enquanto outros foram revertidos para a alimentação das plantas (mais Pentatomomorpha). No entanto, com exceção de saliva usada por kissing bugs para facilitar a alimentação de sangue, pouco é conhecido sobre venenos de heteropteran em comparação com os venenos de aranhas, escorpiões e cobras.
Um obstáculo para a caracterização de toxinas de veneno de heteropteran é a estrutura e função das glândulas de veneno/labial, que são ambos morfologicamente complexos e executar várias funções biológicas (defesa, captura de presas e digestão extra oral). Neste artigo, descrevemos três métodos que usamos com sucesso para coletar heteropteran venenos. Primeiro, apresentamos a eletroestimulação como uma maneira conveniente para coletar o veneno que muitas vezes é letal quando injetado em animais de rapina, e que elimina a contaminação por tecido glandular. Em segundo lugar, nós mostramos que o assédio suave dos animais é suficiente para produzir a extrusão do veneno do narigudo e/ou veneno cuspir em alguns grupos de heteropterans. Em terceiro lugar, descrevemos os métodos para recolher as toxinas de veneno por dissecação de animais anestesiados para obter as glândulas de veneno. Este método é complementar a outros métodos, como podem permitir colheita de toxinas de táxons em que a eletroestimulação e assédio são ineficazes. Estes protocolos permitirá que pesquisadores colher as toxinas do heteropteran insetos para caracterização de estrutura-função e possíveis aplicações na medicina e na agricultura.
Heteropteran venenos são substâncias bioativas potente1. Por exemplo, a secreção de veneno/saliva de sangue-alimentação Heteroptera como kissing bugs (Triatominae) e percevejos (Cimicidae) facilita a alimentação por perturbar a hemostasia2. Toxinas nestes venenos alvo de múltiplas vias, incluindo a coagulação, agregação plaquetária e vasoconstrição, bem como a dor e coceira caminhos. Venenos da maioria das outras espécies de heteropteran são adaptados para facilitar a predação, ao invés de sangue-alimentação. Seus venenos de causam paralisia, morte e liquefação do tecido quando injetado em invertebrados3,4. Quando injetado em animais vertebrados, seu veneno também pode ter efeitos drásticos. Por exemplo, injeção de veneno do inseto assassino Holotrichius innesi em vertebrados causa dor, paralisia muscular e hemorragia; envenomated de ratos por este bug morrer rapidamente devido a paralisia respiratória5.
Transcriptomic e proteomic estudos revelaram a composição de proteína de alguns venenos de heteropteran. Venenos de espécies de predadores são ricos em proteases, outras enzimas e peptídeos e proteínas de estrutura desconhecida e função6,7,8. Kissing bug veneno é rico em triabin proteína da família, cujos membros afetam profundamente a coagulação, agregação plaquetária e vasoconstrição2,9. No entanto, não se sabe quais toxinas subjazem a maioria dos bioactivities de veneno. Por exemplo, o veneno do kissing bug Triatoma infestans foi relatado para ser analgésico e inibe canais de sódio10, mas os componentes responsáveis continuam a ser elucidado. Da mesma forma, não se sabe qual componente ou componentes do veneno de inseto assassino causam paralisia ou dor. Um pré-requisito para identificar as responsável pela bioactivities de veneno especial e para caracterizar a estrutura e função de toxinas de veneno de romance, de toxinas é a obtenção de veneno.
Veneno foi obtido de heteropterans por eletroestimulação5,6,7,8,11,12,13, provocação de defensiva respostas4,8, mecanicamente, apertando o tórax12,14,15,16, dissecando fora as glândulas de veneno8,17 ,18,19,20,21,22e aplicação dos agonistas dos receptores de acetilcolina muscarínicos23. Julgar as potenciais vantagens e desvantagens de qualquer método é complicada pela morfologia das glândulas de veneno heteropteran, que consistem de uma glândula principal com dois lúmens separadas, a glândula principal anterior (AMG) e posterior principal glândula (PMG), bem como um associado a glândula acessória (AG). Esses compartimentos diferentes glândulas produzem secreção de proteínas diferentes, que pode ser especializada para diferentes funções biológicas, incluindo a captura de presas, defesa e digestão extra oral8,17. Em peiratine e ectrichodiine barbeiros, a AMG tem sido associada com a captura de presas e a PMG com digestão extra oral17. No entanto, no harpactorine bug Pristhesancus plagipennis o PMG é especializado para captura de presas e digestão Considerando que a AMG é a hipótese da secretar veneno defensivo8. A AG tem sido descrito como tendo pouca função secretora em barbeiros8 ou como um importante local de armazenamento de protease em bugs de água gigante23. Claramente, mais trabalho é necessário para esclarecer a função de cada compartimento de glândula entre vários subgrupos de heteropteran e para determinar a função da maioria das toxinas do veneno. Neste relatório, descrevemos protocolos para colheita de toxinas de veneno de heteropterans em direção a esse objetivo.
O passo mais crítico na colheita veneno de inseto assassino está selecionando o método apropriado dependendo os propósitos do estudo. Cada um dos três métodos apresentados para colheita heteropteran venenos tem vantagens e desvantagens dependendo de aplicações a jusante.
Indução de bugs para expelir o veneno de probóscide (protocolos de 1-3) evita a contaminação de veneno por tecidos glandulares. Além disso, esses métodos são não-letal e podem ser repetidos muitas vezes ao lon…
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos financeiras suporte do Conselho australiano de pesquisa (bolsas DP130103813 e LP140100832 para G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 para EABU), o Australian National Health & Medical Research Council (bolsa de pesquisa Principal APP1044414 para G.F.K.) e a Universidade de Queensland (Postdoctoral Fellowship para A.A.W.).
Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |