Summary

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca2 +応答をイメージング

Published: May 24, 2018
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Summary

ここでは、赤痢菌に感染した HeLa 細胞によるカルシウム (Ca2 +) 応答を可視化するためのプロトコルを提案する.細菌感染のパラメーターを最適化して Ca2 +蛍光プローブとイメージングにより、非定型グローバルおよびローカル Ca2 +シグナルによる細菌感染速度の広い範囲に、特徴付けられます。

Abstract

Ca2 +は、すべての知られている細胞プロセスにかかわるユビキタス イオンです。全体的な Ca2 +応答は細胞の運命に影響を与える、無料 Ca2 +細胞質濃度で、内部の店舗や細胞膜のチャネルを通じて流入からリリースにリンクされているローカルのバリエーションは皮質細胞プロセスを調整します。病原体に付着またはホスト細胞トリガー グローバルおよびローカル Ca2 +シグナルに影響を与える可能性がありますホスト細胞膜の基礎となるアクチン細胞骨格の再編に侵入します。これらのイベントは、拡張動態上擬似確率的に低周波数で発生可能性があります、ために、病原体による Ca2 +シグナルの解析は対処する必要がある主要な技術的な課題を発生させます。

ここで、上皮細胞の赤痢菌の感染時にグローバルとローカルの Ca2 +シグナルの検出のためのプロトコルを報告します。これらのプロトコルの工芸品は、長期の暴露にリンクし、関連付けられている Ca2 +蛍光プローブの励起光損傷は厳しく、中に定義された時間の期間にわたって集録パラメーターを制御することにより対処法赤痢菌侵略。厳密な化学プローブ蛍光 4 を使用して拡張の感染動態の中に振幅とグローバルのゾル性細胞質の Ca2 +シグナルの頻度を分析する手順が実装されます。

Introduction

Ca2 +細胞骨格の再編、炎症性応答、およびホスト病原体の相互作用1,2,3に関連する細胞死経路を含むすべての知られている細胞プロセスを調整します。生理学的な条件の下で基底細胞内 Ca2 +濃度低い nm の波長範囲の何百ものですが、アゴニスト刺激時に一過性に増加を受けることができます。これらのバリエーションは、プラズマと小胞体膜にポンプやチャネルの作用により振動現象をしばしば示します。これらの振動のパターンと期間、期間、および Ca2 +増加の振幅によって特徴付けられる細胞は、ターンでは、Ca2 +のコード4,5 として知られている特定の応答をトリガーによって復号化.病理学の条件下でのゾル性細胞質の Ca2 +濃度の持続的な増加は、ミトコンドリア膜の透過と pro アポトーシスや壊死の要因6のリリースに関連する細胞死につながる可能性があります。 7

赤痢、細菌性赤痢の病原には、タイプ III の分泌システム (T3SS)8,9を使用して宿主細胞にエフェクターを注入することで上皮細胞が侵入します。宿主細胞の赤痢菌の侵入は、ローカルおよびグローバルな Ca2 +シグナル、T3SS によって誘発されるに関連付けられます。細孔形成に関しては毒素、宿主細胞膜に挿入し T3SS エフェクタの注入はほとんどの場合が必要 T3SS トランスロコン PLC と (1、4、5) イノシトール三リン酸 (InsP3) の活性化に関与-従属 Ca2 +リリース。ローカライズされた PLC 刺激と赤痢菌侵入結果、になって長期 InsP3 依存性 Ca2 +のサイトで重合のアクチンの蓄積の組み合わせ10 月に発売します。タイプ III エフェクター IpgD、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2)-4-ホスファターゼ、PIP2、それによりローカル Ca2 +の閉じ込めに貢献する InsP3 を生成する PLC の利用可能な基質の量を制御するローカル量に制限細菌の侵入サイト11,12の応答。赤痢菌の侵入サイト10でアクチンの重合に寄与するこれらローカル Ca2 +応答可能性があります。ただし、赤痢菌、によって誘発される、またグローバルの Ca2 +反応が細菌侵入プロセスに不可欠であるコネキシン hemichannels プラズマ膜の開口部と、細胞内 ATP の放出をトリガーコンパートメントです。リリースされた ATP パラクリン的演技が感染した細胞の隣の細胞内 Ca2 +振動応答を刺激します。IpgD は遅いダイナ ミックスと常軌を逸した分離応答に全体的な Ca2 +応答を形成するための責任も。最終的には、長期にわたる細菌感染時に IpgD は InsP3 を介した Ca2 +シグナルの抑制につながります。Ca2 +シグナル伝達とその干渉、IpgD 遅延 Ca2 +-焦点接着構造の分解との早期剥離につながる依存カルパイン活性化感染細胞13

一方、Ca2 +シグナルは、病因の重要な側面に関与している、微生物の使用は古典的なアゴニスト研究では見られない技術的な課題の数を発生させます。説明プロトコルここでインジケーターを使用して一般的に使用される蛍光 Ca2 +化学蛍光 4 我々 は赤痢菌の感染時にローカル Ca2 +信号の特性評価に設計されました。細菌のエフェクターの Ca2 +シグナル伝達の役割の特性評価に必要なその定量的評価の実施手順と同様、これらの信号の検出のための重要な手順を説明します。

Protocol

1. 準備 細菌の準備 細菌をプレート-赤痢菌野生株 AfaE 双球菌 (M90T AfaE) を表現する-、トリプチ大豆 (TCS) 寒天プレート含む 0.01% コンゴーレッド (CR) と 37 ° C で 18 h にそれらをインキュベート注: その再現性を高めるため 1.1.1 手順で取得した赤痢菌プレートは 4 ° C で格納され、CR の媒体上のすべてのコロニーは最終的に時間をかけて赤回すために、?…

Representative Results

赤痢菌の侵入は非定型の長期的なローカル Ca2 +応答に関連付けられています。 上記のプロトコルに従い WT赤痢菌と挑戦された蛍光 4 読み込まれた HeLa 細胞と Ca2 +信号を解析するストリームを買収を行った。代表的な実験は単一セルと対応する位相コントラスト (図 1 a、左?…

Discussion

本稿では、我々 は、全体的な Ca2 +応答と同様に、赤痢菌侵入の比較的短い動態の中に赤痢菌の拡張動態の中にローカル Ca2 +シグナルに従う設計プロトコルについて説明します。以下、Ca2 +の検出能力を最適化に対処する必要がある問題を見つけることができますキーは生物的プロセスとの干渉を最小限に抑えながら信号します。

化学<e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ジェニー ・ リー Thomassin は、編集原稿で彼女の助けを感謝いたします。仕事は、ANR によって支えられた助成金 MITOPATHO や PATHIMMUN、Labex Memolife と PSL アイデックス Shigaforce から付与します。春暉太陽中国公費から博士の付与の受信者であります。ローラン Combettes 男 Tran ヴァン状態、WBI フランス exchange Tournesol プログラム N ° 31268YG の受信者 (Wallonie ブリュッセル国際、フォン デ ラ凝った日仏、ミニステール Français デ アフェール étrangères et アーツアンドクラフツ、ミニステール デ期高等エ デ ラ凝った dans ル幹部デ Partenariats ヒューバート Curien)。

Materials

Fluo-4 AM Invitrogen F14201
Metamorph version 7.7 Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2 Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high  IBIDI 81156
Trypticase Soy (TCS) broth Thermofisher B11768
TCS agar Thermofisher B11043
Congo red Sigma-Aldrich 75768
M90T-AfaE Sun et al. 2017 Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE Sun et al. 2017 isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin

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Cite This Article
Smail, Y., Sun, C., Combettes, L., Tran Van Nhieu, G. Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (135), e57728, doi:10.3791/57728 (2018).

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