Summary

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Published: May 24, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Kalzium (Ca2 +) Reaktionen hervorgerufen durch HeLa-Zellen infiziert durch Shigellazu visualisieren. Durch die Optimierung der Parameter der bakteriellen Infektion und Bildgebung mit Ca2 + fluoreszierende Sonden, sind atypische globaler und lokaler Ca2 + Signale über einen grossen Bereich der Infektion Kinetik durch Bakterien verursachten gekennzeichnet.

Abstract

Ca2 + ist eine allgegenwärtige Ion alle bekannten zellulären Prozessen beteiligt. Während globale Ca2 + Antworten Zelle Schicksal beeinträchtigen können, Regeln lokale Variationen in frei Ca2 + cytosolischen Konzentrationen, verbunden zum lösen vom internen Speicher oder einen Zustrom durch Plasmamembran Kanäle, kortikale Zellprozesse. Krankheitserreger, die an oder dringen Host Zellen Trigger eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts zugrunde liegenden Host Plasmamembran, die wahrscheinlich sowohl auf globaler als auch auf lokalen Ca2 + Signalisierung betrifft. Da diese Ereignisse bei niedrigen Frequenzen in einer Pseudo-stochastische Weise über erweiterte Kinetik auftreten können, wirft die Analyse von Ca2 + Signale durch Krankheitserreger verursacht große technischen Herausforderungen, die angegangen werden müssen.

Hier berichten wir Protokolle zum Nachweis von globalen und lokalen Ca2 + Signale auf eine Shigella Infektion der Epithelzellen. In diesen Protokollen Artefakten verknüpft zu einer längeren Exposition und lichtbedingten verbunden mit der Anregung von Ca2 + fluoreszierende Sonden sind streng kontrollieren die Aufnahmeparameter über definierte Zeiträume während einer Fehlerbehebung Shigella Invasion. Verfahren werden implementiert, um konsequent die Amplitude und Frequenz der globalen cytosolischen Ca2 + Signale analysieren während der ausgedehnten Infektion Kinetik mit der chemischen Sonde Fluo-4.

Introduction

Ca2 + regelt alle bekannten Zellprozesse, einschließlich Zellskelett Reorganisation, Entzündungsreaktionen und Zelle Tod Wege im Zusammenhang mit Wirt-Pathogen Interaktionen1,2,3. Unter physiologischen Bedingungen basale cytosolische Ca2 + Konzentrationen sind niedrig, in den Hunderten von nM-Bereich, aber können zu einem vorübergehenden Anstieg nach Agonist Stimulation unterzogen werden. Diese Variationen zeigen oft oszillierende Verhalten durch das Wirken von Pumpen und Kanäle im Plasma und endoplasmatische Retikulum Membranen. Das Muster dieser Schwingungen zeichnet sich durch die Zeit, Dauer und Amplitude der Ca2 + erhöht und wird durch Zellen, die wiederum bestimmte Reaktionen lösen in, was als Ca2 + Code4,5 bekannt entschlüsselt . Eine nachhaltige Steigerung der cytosolischen Ca2 + Konzentration unter pathologischen Bedingungen führen zum Zelltod führt die Permeabilisierung der mitochondrialen Membranen und die Freisetzung von Pro-apoptotische oder nekrotischen Faktoren6zugeordnet, 7.

Shigella, dem Erreger der bazillendysenterie, dringt Epithelzellen durch Einspritzen von Effektoren in Wirtszellen mit einem Typ III-Sekretion System (T3SS)8,9. Eine Shigella -Invasion von Wirtszellen ist verbunden mit lokalen und globalen Ca2 + Signale ausgelöst durch die T3SS. Für Pore bilden Giftstoffe, die T3SS-Translocon, die fügt in Host Zellmembranen und ist erforderlich für die Injektion von T3SS Effektoren wahrscheinlich ist verantwortlich für die Aktivierung der SPS und der Inosit (1, 4, 5)-Trisphosphate (InsP3)-abhängige Ca2 + lassen Sie los. Die Kombination aus der lokalisierten PLC-Stimulation und die Anhäufung von polymerisierten Aktin an Standorten eines Shigella Invasion führen eine untypisch lang andauernde InsP3-abhängige Ca2 + release10. Der Typ-III-Effektor IpgD, ein Phosphatidyl 4,5-Bisphosphate (PIP2)-4-Phosphatase, beschränkt die lokalen PIP2, wodurch die Steuerung der Menge der verfügbaren Substrat für SPS, InsP3, generieren, die an die enge des lokalen Ca2 + trägt Antworten bei bakteriellen Invasion Seiten11,12. Diese lokalen Ca2 + Antworten wahrscheinlich dazu beitragen, die Aktin-Polymerisation bei Shigella Invasion Websites10. Globalen Ca2 + Antworten, die jedoch auch durch Shigella, ausgelöst werden sind entbehrlich für die bakterielle Invasion Prozess aber auslösen, die Öffnung der Connexin-Hemichannels an der Plasmamembran und die Freisetzung von ATP in der extrazellulären Fach. Freigesetzte ATP Parakrine handeln, stimuliert wiederum Ca2 + oszillierende Reaktionen in den Zellen neben der infizierten Zelle. IpgD ist auch verantwortlich für die Gestaltung der globalen Ca2 + Antworten zu unberechenbar isolierten Reaktionen mit langsamen Dynamik. IpgD führt schließlich, nach einer längeren bakterielle Infektion auf die Hemmung der InsP3-vermittelten Ca2 + Signale. Durch seine Einmischung mit Ca2 + Signalisierung IpgD verzögert eine Ca2 +-abhängigen Calpain Aktivierung führt zu die Demontage der fokale Adhäsion Strukturen und die vorzeitige Ablösung von infizierten Zellen13.

Während Ca2 + Signale wichtige Aspekte der Pathogenese beteiligt sind, wirft die Verwendung eines Mikroorganismus eine Reihe von technischen Herausforderungen, die nicht im klassischen Agonist Studien anzutreffen sind. Die Protokolle beschrieben verwenden Sie hier die häufigsten verwendeten fluoreszierenden Ca2 + chemischen Indikator Fluo-4, die wir entwickelt, um lokale Ca2 + Signale während einer Shigella Infektion zu charakterisieren. Schritte für die Erkennung dieser Signale werden erläutert, sowie Verfahren für die Quantitative Analyse, die erforderlich sind, um die Rolle der bakteriellen Effektoren in Ca2 + Signalisierung zu charakterisieren.

Protocol

1. Vorbereitungen Bakterien-Vorbereitung Platte die Bakterien –Shigella Wildtyp Stamm mit dem Ausdruck der AfaE adhäsin (M90T-AfaE) – auf einem Trypticase Soja (TCS) Agar Platte mit 0,01 % Kongo-rot (CR) und inkubieren sie 18 h bei 37 ° C.Hinweis: Um ihre Reproduzierbarkeit zu erhöhen, die Shigella -Platten in Schritt 1.1.1 erhaltenen bei 4 ° C gelagert werden und sollte innerhalb einer Woche verwendet werden, da alle Kolonien auf CR-Medium im Laufe der …

Representative Results

Shigella Invasion ist atypisch lang anhaltende lokale Ca2 + Antworten zugeordnet: Nach dem oben genannten Protokoll Fluo-4 geladen HeLa-Zellen wurden mit WT Shigella herausgefordert und Stream Akquisitionen wurden durchgeführt, um Ca2 + Signale analysieren. Abbildung 1zeigt eine repräsentative Experiment mit Zeitraffer-Bilder-Serie von der Fluoreszenzintensitä…

Discussion

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll, das wir entwickelt, um lokale Ca2 + Signale während der relativ kurzen Kinetik einer Shigella -Invasion, sowie globale Ca2 + Antworten während der erweiterten Kinetik von Shigellazu folgen. Im folgenden Signale Schlüssel finden Sie Themen, die angesprochen werden, um die Erkennung von Ca2 + optimieren müssen bei gleichzeitiger Minimierung der Interferenzen mit der biologischen Prozesse.

Chemischen <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für ihre Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts Jenny-Lee Thomassin. Die Arbeit wurde unterstützt durch die ANR gewährt, MITOPATHO und PATHIMMUN, aus dem Labex Memolife und PSL IDEX Shigaforce gewährt. Chunhui Sonne ist ein Empfänger Ph.d. von der China Scholarship Council. Laurent Combettes und Guy Tran Van Nhieu sind Empfänger von einem WBI-Frankreich-Austausch Tournesol Programm N ° 31268YG (Wallonie-Brüssel International, Fonds De La Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires Étrangères et Européennes, Ministère de nannte Supérieur et De La Recherche Dans le Cadre des Partenariats Hubert Curien).

Materials

Fluo-4 AM Invitrogen F14201
Metamorph version 7.7 Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2 Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high  IBIDI 81156
Trypticase Soy (TCS) broth Thermofisher B11768
TCS agar Thermofisher B11043
Congo red Sigma-Aldrich 75768
M90T-AfaE Sun et al. 2017 Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE Sun et al. 2017 isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin

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Cite This Article
Smail, Y., Sun, C., Combettes, L., Tran Van Nhieu, G. Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (135), e57728, doi:10.3791/57728 (2018).

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