Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.
Abstract
Microenvironnement immunitaire de tumeur (temps) a récemment été reconnu comme un médiateur essentiel de la réponse au traitement dans les tumeurs solides, surtout pour les immunothérapies. Récents progrès cliniques en immunothérapie soulignent la nécessité de méthodes reproductibles avec précision et bien caractériser la tumeur et son infiltrat immune associée. Digestion enzymatique de tumeur et cytométrie permettent large caractérisation de nombreux sous-ensembles de cellules immunitaires et les phénotypes ; Cependant, profondeur d’analyse est souvent limitée par des restrictions de fluorophore sur planche de bord et la nécessité d’obtenir des échantillons de grande tumeur d’observer les rares populations immunitaires d’intérêt. Ainsi, nous avons développé une méthode efficace et haut débit de séparation et d’enrichir l’infiltrat immunitaire de tumeur des composants non immuns tumeur. La digestion de la tumeur décrit et séparation centrifuge axée sur la densité technique permet distincte caractérisation de la tumeur et tumeur immunitaires infiltrant fractions et préserve la viabilité cellulaire et offre donc une large caractérisation de la tumeur État immunologique. Cette méthode a été utilisée pour caractériser la vaste abri l’hétérogénéité spatiale des tumeurs solides, qui démontre également la nécessité pour les techniques de profilage immunologiques compatibles toute tumeur. Dans l’ensemble, cette méthode fournit une technique efficace et adaptable pour la caractérisation immunologique de sous-cutanée tumeurs murines solides ; à ce titre, cet outil peut servir à mieux caractériser les fonctions immunologiques tumorales ainsi que l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Introduction
Le temps suppressif a récemment été reconnu comme une caractéristique du cancer et est connu pour jouer un rôle important dans le développement, la progression et la protection des cancers de tumeur solide mais aussi atténuer leur sensibilité à l’immunothérapie1. Le temps est composé de nombreux sous-ensembles cellulaires et les phénotypes, qui donnent un aperçu critique de l’État immunologique de la tumeur. Ces sous-ensembles immunologiques peuvent être encore divisés en cellules lymphocytaires ou origine myéloïde, qui constituent la majorité des réponses immunitaires innée et adaptative2,3. Les progrès récents dans le domaine de l’immunothérapie des cancers ont montré que des stratégies immunothérapeutiques (c.-à-d., les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, récepteur de l’antigène chimérique T-cellules, etc.) sont susceptibles de provoquer le cancer durable régressions ; Cependant, ils restent relativement inefficaces dans les tumeurs solides cancer4,5. Plusieurs groupes ont montré l’obstacle essentiel que le temps peut jouer sur traitement succès6,7, et par conséquent, il reste nécessaire d’évaluer avec précision les nouvelles immunothérapies dans le paramètre préclinique en se concentrant spécifiquement sur leur capacité à moduler ou à surmonter le temps8.
Les efforts actuels pour caractériser le temps généralement utilisent soit la microscopie ou cytométrie avec anticorps étiquetage des stratégies pour identifier les sous-ensembles cellulaires immunitaires et leurs caractéristiques9,10. Ces deux stratégies fournissent des informations particulièrement bien différentes, comme la microscopie permet de reconnaissance spatiale des sous-ensembles cellulaires et cytométrie offre un débit élevé et une quantification plus large des changements cellulaires. Malgré les améliorations récentes en immunohistochimie multiplexe fluorescent, optimisation des systèmes d’imagerie spectrales, qui maintenant peuvent prendre en charge jusqu’à 7 paramètres, taille du panneau limité est difficile niveau large abri de profilage et cette technique est donc souvent réservé aux plus axé sur les analyses. En conséquence, cytométrie de flux reste l’un du plus largement utilisé immunitaire techniques de profilage. Malgré son utilisation répandue dans la caractérisation de l’époque, les méthodes utilisées pour le traitement et la coloration sont très variables. Le plus souvent de protocoles utilisent une tumeur dissociation enzymatique (c.-à-d., collagénases, DNase, etc.) et méthodes de dissociation manuel pour réaliser des suspensions de cellules individuelles, suivie d’anticorps coloration et analyse7. Malgré les avantages de chaque méthode, plusieurs groupes ont montré la variabilité importante qui peut être induite par le biais de ces techniques11. Cela rend les comparaisons de croix-étude du profilage de microenvironnement tumoral extrêmement difficile, même lors de l’évaluation le même modèle de tumeurs murines. En outre, ces méthodes fournissent un potentiel limité pour évaluer la tumeur cellulaire et immunitaire tumeur infiltrer composants séparément, étant donné que les deux composants sont intercalés après digestion. Quantité d’échantillon limite puis MultiPanel coloration et analyse, qui devient un enjeu majeur lors de la tentative de caractériser les sous-ensembles immunologiques rares (c.-à-d. spécifique lymphocytes)12. Techniques plus récentes comme masse cytométrie en flux, ou cytométrie par temps de vol (CyTOF), permettent une analyse phénotypique haute dimension de sous-ensembles cellulaires avec certains systèmes supportant les conceptions du panneau supérieur à 42 paramètres indépendants13. Malgré la formidable puissance de la technologie CyTOF dans profilage immunitaire, il reste limité en raison de la dépense, expertise de l’analyse et l’accès à l’équipement. En outre, plusieurs protocoles de CyTOF recommandent purification des sous-ensembles immunitaires afin d’améliorer les rapports signal sur bruit14et ainsi, nous suggérons que notre méthode d’enrichissement pourrait être utilisée en amont de l’analyse CyTOF pour améliorer la qualité des données.
Nous décrivons ci-après une digestion microenvironnement tumoral et analyse méthode qui incorpore immunitaire tumeur s’infiltrer dans la séparation. Le but de cette méthode est de permettre à haut débit indépendant profilage des fractions cellulaires tumorales pour une caractérisation plus large du microenvironnement tumoral et infiltrat immunisée tumoral. En utilisant cette méthode, par ailleurs démontrent l’importance d’effectuer des analyses de toute tumeur, comme un modèle de tumeur solide sous-cutanée a été constaté que l’hétérogénéité spatiale immunologique significative. Dans l’ensemble, cette méthode peut plus précisément et uniformément comparer entre les échantillons car elle enrichit pour des sous-ensembles cellulaires immunitaires au sein de la tumeur et permet pour le profilage indépendante de la cellule tumorale et immunitaires fractions d’une tumeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le temps est composé de molécules et les composants cellulaires diverses et complexes. Récentes indiquent que la caractérisation précise de cet environnement peut fournir une meilleure compréhension de la réussite du traitement ou d’échec et peut même aider à identifier les mécanismes de résistance thérapeutique. Par exemple, intratumorale niveaux croissants de diverses cellules immunosuppresseurs (c.-à-d., MDSCs, les lymphocytes T régulateurs, etc.) peuvent atténuer les réponses immu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN reconnaît financièrement par le National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) et le National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) de la National Institutes of Health. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce projet a également bénéficié de la cytométrie en flux et noyau de tri cellulaire au Baylor College of Medicine financée par les NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 et S10 RR024574) et l’aide des experts de Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
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