肿瘤免疫和非免疫微环境在小鼠皮下肿瘤中的富集与鉴定
Summary
在这里, 我们描述了一个方法, 以分离和丰富的组成部分, 肿瘤免疫和非免疫微环境的建立皮下肿瘤。该技术允许对肿瘤免疫浸润和非免疫肿瘤分数进行单独分析, 从而可以对肿瘤免疫微环境进行综合表征。
Abstract
肿瘤免疫微环境 (时间) 最近被认为是一个关键的调解者的治疗反应, 在实体肿瘤, 特别是免疫疗法。最近在免疫治疗方面的最新进展突出了需要重现的方法, 准确和彻底的特点肿瘤及其相关的免疫渗透。肿瘤酶消化和流细胞分析可以广泛地描述多种免疫细胞亚群和表型;然而, 分析的深度往往受到限制的荧光限制的面板设计和需要获得大量的肿瘤样本, 以观察罕见的免疫人群的兴趣。因此, 我们已经开发出一种有效的高通量的方法来分离和丰富肿瘤免疫浸润的非免疫肿瘤成分。所描述的肿瘤消化和离心密度分离技术允许分离的肿瘤和肿瘤免疫浸润分数的特点, 并保持细胞活力, 从而提供了一个广泛的描述肿瘤免疫状态。该方法用于表征实体肿瘤中广泛的空间免疫异质性, 进一步证明了对肿瘤免疫分析技术的一致性要求。总体上, 该方法为皮下固体小鼠肿瘤的免疫学特性提供了一种有效、适应性强的技术;因此, 这个工具可以用来更好地表征肿瘤免疫功能和在临床前评价新的免疫治疗策略。
Introduction
抑制时间最近被认为是癌症的一个标志, 众所周知, 在肿瘤的发展、进展和保护方面发挥重要作用, 并减轻他们对免疫治疗1的敏感性。时间由大量的细胞子集和表型组成, 所有这些都为肿瘤的免疫状态提供了重要的洞察力。这些免疫亚群可以进一步分层成淋巴细胞或髓系细胞的起源, 这共同构成了大多数先天和适应性免疫反应2,3。最近在癌症免疫治疗领域的进展表明, 免疫治疗策略 (即免疫检查点抑制剂, 嵌合体抗原受体 T 细胞等) 有可能导致持久性癌症回归然而, 它们在4、5的实体肿瘤癌症中仍然相对无效。许多团体已经显示了时间可以在治疗成功6,7的关键障碍, 因此, 仍然需要准确地评估新的免疫疗法在临床前的设置专门关注其能够调节或克服时间8。
目前的工作特点的时间通常利用显微镜或流式细胞术, 以及抗体标签策略, 以确定免疫细胞子集和其特点9,10。这两种策略提供独特的不同信息, 因为显微镜允许细胞子集的空间欣赏和流式细胞术提供高吞吐量和更广泛的细胞变化量化。尽管最近有改进的荧光复合免疫组化优化光谱成像系统, 现在可以支持多达7参数, 有限的面板大小使广泛的免疫分析困难, 因此这种技术往往为更集中的分析预留。因此, 流式细胞术仍然是最广泛使用的免疫分析技术之一。尽管其在时间表征中的广泛应用, 但用于加工和染色的方法相当多变。通常的协议使用肿瘤游离酶 (即胶原酶, DNase等) 和手工离解方法, 以实现单细胞悬浮, 其次是抗体染色和分析7。尽管每种方法都有好处, 但许多群体显示了通过这些技术11可以诱发的广泛的变异性。这使得跨研究比较的肿瘤微环境分析非常困难, 即使在评估相同的小鼠肿瘤模型。此外, 这些方法提供了有限的潜力, 以评估肿瘤细胞和肿瘤免疫渗透成分独立, 因为两个组成部分是散置后消化。样本数量, 然后限制多面板染色和分析, 这成为一个主要的问题时, 试图描述罕见的免疫子集 (即肿瘤特异性 T 细胞)12。最近的技术, 如大规模细胞术, 或飞行时间的细胞术 (CyTOF), 允许高维细胞子集的表型分析与一些系统支持面板设计超过42独立参数13。尽管 CyTOF 技术在免疫分析方面具有巨大的威力, 但由于费用、分析专业知识和对设备的访问, 它仍然受到限制。此外, 许多 CyTOF 协议建议纯化免疫子集, 以提高信噪比14, 因此我们建议, 我们的浓缩方法可以用于 CyTOF 分析的上游, 以提高数据质量。
在此, 我们描述了一种肿瘤微环境消化和分析方法, 纳入肿瘤免疫渗透分离。这种方法的目的是允许独立高通量的肿瘤免疫浸润和肿瘤细胞分数的分析, 以更广泛地描述肿瘤微环境。利用该方法, 我们进一步论证了进行全肿瘤分析的重要性, 认为皮下实体瘤模型具有显著的空间免疫异质性。总的来说, 这种方法可以更准确和一致地比较样本, 因为它丰富的免疫细胞亚群在肿瘤和允许独立的分析肿瘤细胞和免疫分数的肿瘤。
Protocol
Representative Results
Discussion
时间由多种复杂的细胞成分和分子组成。最近的证据表明, 准确的描述这个环境可以提供更好的理解治疗成功或失败, 甚至可以帮助确定机制的治疗耐药性。例如, 增加各种免疫抑制细胞 (如MDSCs、T 调节细胞等) 的瘤内水平, 可以减轻效应的免疫应答, 并消除免疫治疗效应。另一方面, 效应免疫种群 (如肿瘤特异性 CD8+ t 细胞、自然杀伤细胞、t 辅助细胞) 的瘤内存在增加, 可以成为?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN 承认国家卫生研究院 (T32GM088129) 和国立牙科 & 颅颌面部研究研究所 (F31DE026682) 的财政支持。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方意见。这个项目也得到了在贝勒医学院的细胞和细胞分类核心的支持, 从 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, S10 RR024574) 的资助和乔尔 m. Sederstrom 的专家协助。
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
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