Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.
La riparazione delle rotture a doppio filamento (DSBs) nel DNA è un processo altamente coordinato, rendendo necessaria la formazione e la risoluzione di complessi di riparazione della multi-proteina. Questo processo è regolato da una miriade di proteine che promuovono l’associazione e dissociazione delle proteine a queste lesioni. Grazie in gran parte alla capacità di eseguire schermi funzionali di una vasta libreria di proteine, c’è un maggiore apprezzamento dei geni necessari per la riparazione di rottura del DNA double-strand. Schermi di inibitore spesso knockout o chimici identificano proteine coinvolte nei processi di riparazione utilizzando tossicità aumentata come indicatore per una proteina che è necessaria per la riparazione DSB. Sebbene sia utile per identificazione romanzo proteine cellulari coinvolte nel mantenimento della fedeltà del genoma, analisi funzionale richiede la determinazione di se la proteina di interesse promuove la localizzazione, la formazione o la risoluzione di complessi di riparazione.
L’accumulo di proteine di riparazione può essere facilmente individuata come distinti foci nucleari da microscopia di immunofluorescenza. Così, associazione e dissociazione di queste proteine nei siti di danno del DNA può essere letta osservando questi fuochi nucleari intervalli rappresentativi dopo l’induzione di rotture a doppio filamento del DNA. Questo approccio può anche identificare proteine del fattore di riparazione mis-localizzata, se difetti di riparazione non si verificano simultaneamente con incompleti ritardi nella riparazione. In questo scenario, lunga durata rotture a doppio filamento del DNA possono essere progettate esprimendo un’endonucleasi di taglio raro (ad es., SceI) in cellule dove il sito di riconoscimento per l’enzima suddetto è stato integrato nel genoma della cellula. La lesione risultante è particolarmente difficile da risolvere come fedele riparazione reintrodurrà il sito di riconoscimento dell’enzima, che richiede un altro giro di clivaggio. Di conseguenza, vengono eliminate le differenze nella cinetica della riparazione. Se non si formano complessi di riparazione, localizzazione è stato ostacolato. Questo protocollo descrive la metodologia necessaria per identificare le modifiche nella cinetica di riparazione, nonché la localizzazione della proteina di riparazione.
Ogni giorno, ogni cellula nel corpo umano è bombardato con un 10.000 stimato DNA lesioni1. Questa minaccia esistenziale ci mette a rischio di mutazioni, oncogenesi, nonché delle cellule morte. Per proteggere la fedeltà del genoma, le cellule di mammiferi si sono evolute per rispondere a danno del DNA con una complessa serie di associazioni di proteina e modifiche. Questa risposta è organizzata in più percorsi, conosciuti collettivamente come il DNA danni risposta (DDR)2,3. Il DDR è costituito dall’accumulo di proteine di riparazione del DNA alle lesioni del DNA, coordinate sia temporalmente e spazialmente. DDR frequentemente induce arresto del ciclo cellulare per evitare la propagazione o l’intensificazione dei danni che possono verificarsi durante la replica di danneggiato DNA2,4,5. A sua volta, è anche necessario per la vitalità cellulare si disattiva arresto del ciclo cellulare tramite la dissociazione complessi di riparazione dopo la riparazione è stata completata.
Tra le varie tipologie di danno del DNA, DSBs sono più deleteri. Omissione di riparare DSBs può provocare di riarrangiamenti cromosomici o eliminazioni su larga scala come la perdita di braccia di intero cromosoma. La riparazione di DSBs è diviso in due percorsi6,7,8. Ricombinazione omologa (HR) richiede una sorella cromosoma da utilizzare come un modello di DNA e quindi è limitato a fine fasi S e G2/M del ciclo cellulare9,10. Non-omologa fine unirsi (NHEJ) non hanno queste limitazioni ma può causare piccole omissioni quando riparare DSBs11,12.
DSB riparazione specificamente e il DDR in generale sono aree attive di indagine. Pur essendo organizzati in vie convenientemente separate, c’è una grande quantità di ridondanza. Infatti, molte proteine (BRCA1, BRCA2 e il RPA complessa per esempio) sono coinvolti in molteplici vie13,14,15,16. La riparazione di una lesione di una via, può portare a danni intermedio che devono essere riparato da un altro percorso14. L’intreccio di queste vie, combinate con il loro complesso compito di reclutare le proteine giuste al posto giusto per la precisa quantità di tempo necessario, richiede un processo di regolamentazione multilivello.
Un recente rapporto mette in evidenza la complessità della DDR dimostrando che formazione di complessi di riparazione, la risoluzione e la localizzazione può ciascuno separatamente essere alterata17. L’obiettivo generale del seguente protocollo è definitivamente dissezionare la capacità delle cellule di riparare DSB. Usando la microscopia di immunofluorescenza, accumulo di proteine di riparazione presso i siti di danno possa essere visualizzato nei punti di tempo rappresentativo dopo l’induzione di DSBs.
Questa tecnica ha diversi vantaggi per gli approcci comunemente utilizzati. Riparazione è spesso studiati intervalli di tempo singolo e incapace di rappresentare il processo dinamico dell’Assemblea e la dissociazione dei complessi di riparazione. Osservando l’intera gamma di riparazione dall’attivazione iniziale a piena risoluzione assicura che un ritardo nella riparazione non è erroneamente identificato come l’inibizione completa. Al contrario, assicura che l’induzione di una risposta di riparazione che è in grado di inattivare tale riscontro non è erroneamente identificato come il normale o l’eccessiva attivazione.
Formazione dei complessi della proteina in ritardo e la mis-localizzazione delle proteine di riparazione, tuttavia, può non essere inequivocabilmente distinto con questo approccio. Per determinare se proteine di riparazione sono mis-localizzate contro il ritardo nella loro localizzazione, una “lunga durata” DSB può essere introdotto attraverso scissione enzimatica del DNA cellulare. La lesione risultante è ripassare ogni volta che si è riparato, risultante in un focus distinti grande riparazione nucleare ed eliminando la limitazione temporale dal reclutamento. Ciò può essere ottenuto modificando l’approccio esistente con l’uso di un’endonucleasi di taglio raro (ad es., SceI) per indurre un DSB di lunga durata. La longevità di DSBs consente la visualizzazione delle proteine di riparazione sfuggente da microscopia di immunofluorescenza. L’abbondanza di avanzata potrebbe anche migliorare la visualizzazione quando il rilevamento è ostacolato dalla limitazione della qualità di anticorpo, una caratteristica che potrebbe essere utile quando meno proteine studiate sono identificate come aventi un impatto sulla riparazione del DNA.
In particolare, forniamo istruzioni esplicite per un immagini elaborazione ed analisi software (ad es., ImageJ). Consente di rimuovere un ostacolo finanziario analisi dell’immagine, aprendo l’interrogatorio di riparazione di danni del DNA ad un pubblico più ampio.
L’analisi del DNA danni riparazione in generale e la riparazione delle rotture del DNA double-stranded in particolare è un’area attiva di ricerca, poiché le sue conseguenze estendono su tumorigenesi a biologia di base6,20. Questo dettagli di manoscritto un approccio che analizza con precisione il contributo delle proteine RAD51 e γ-H2AX alla risoluzione di DSBs attraverso HR. guardando al futuro, questo metodo può essere usato per delucidare ulteriori funzion…
The authors have nothing to disclose.
Grazie a Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann del nucleo di microscopia confocale, finanziato da la Kansas State University College di medicina veterinaria, per il loro sostegno degli sforzi per sviluppare questa tecnica. pCBASceI era un regalo di Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. Le cellule U2OS DR-GFP erano un regalo gentile da Maria Jasin18.
12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
24-well plate | VWR | 82050-892 | |
96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |