Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie
Summary
Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.
Abstract
De reparatie van double-stranded pauzes (DSBs) in het DNA is een sterk gecoördineerde proces, waardoor de vorming en de resolutie van multi eiwit reparatie complexen. Dit proces wordt gereguleerd door een groot aantal proteïnen ter bevordering van de vereniging en scheiding van proteïnen om deze letsels. Bedankt voor een groot deel de mogelijkheid tot het uitvoeren van functionele screens van een enorme bibliotheek van eiwitten, er is een grotere waardering van de genen nodig voor de dubbel-streng DNA breuk reparatie. Vaak afvalrace of chemische remmer schermen identificeren eiwitten die betrokken zijn in de reparatie processen met behulp van verhoogde toxiciteit als een marker voor een eiwit dat is vereist voor DSB reparatie. Hoewel nuttig voor herkenbare roman cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij het handhaven van genoom trouw, vereist functionele analyse de vaststelling van of de proteïne van belang lokalisatie, vorming of resolutie van reparatie complexen bevordert.
De ophoping van eiwitten van de reparatie kan gemakkelijk worden gedetecteerd als verschillende nucleaire foci door immunofluorescentie microscopie. Dus, vereniging en scheiding van deze proteïnen bij plaatsen van DNA-beschadiging toegankelijk zijn door het observeren van deze nucleaire foci representatieve tussenpozen na de inductie van dubbele streng DNA pauzes. Deze benadering kan ook mis gelokaliseerde reparatie factor eiwitten, worden geïdentificeerd als reparatie gebreken niet gelijktijdig met onvolledige vertragingen in reparatie voorkomen. In dit scenario kunnen langdurige dubbel-streng DNA breekt in cellen waar de site van de erkenning voor de genoemde enzym is geïntegreerd in het cellulaire genoom met het uitspreken van een zeldzame snijden endonuclease (b.v., SceI) worden ontworpen. De resulterende laesie is vooral moeilijk op te lossen als trouwe reparatie zal opnieuw van het enzym erkenning site, waarin wordt gevraagd een andere ronde van decollete. Dientengevolge, worden verschillen in de kinetiek van de reparatie opgeheven. Als reparatie complexen worden niet gevormd, heeft lokalisatie gehinderd. Dit protocol beschrijft de methodologie die nodig zijn ter specificatie van de veranderingen in de kinetiek van de reparatie, alsmede reparatie eiwit lokalisatie.
Introduction
Elke dag, elke cel in het menselijk lichaam wordt gebombardeerd met een geschatte 10.000 DNA laesies1. Deze existentiële bedreiging brengt ons in gevaar voor mutaties, oncogenese evenals cel dood. Ter bescherming van genoom trouw, cellen van zoogdieren geëvolueerd om te reageren op de DNA-beschadiging met een complexe reeks van eiwit verenigingen en wijzigingen. Deze reactie is ingedeeld in meerdere paden, gezamenlijk bekend als de DNA schade reactie (DDR)2,3. De DDR bestaat uit de accumulatie van DNA reparatie eiwitten op DNA laesies, zowel stoffelijk als ruimtelijk gecoördineerd. DDR induceert vaak celcyclus arrestatie om de propagatie of de intensivering van de schade die tijdens de replicatie van beschadigde DNA2,–4,5 optreden kante vermijden. Op zijn beurt, is het ook noodzakelijk voor de cellulaire levensvatbaarheid voor zwenking vandoor celcyclus arrestatie door distantieer reparatie complexen nadat reparatie is voltooid.
De verschillende soorten DNA-beschadiging behoren DSBs tot de meest schadelijke. Falen om te herstellen van de DSBs kan leiden tot chromosoom herschikkingen of grootschalige verwijderingen zoals het verlies van gehele chromosoom wapens. De reparatie van de DSBs is verdeeld in twee trajecten6,–7,8. Homologe recombinatie (HR) vereist een zus chromosoom te gebruiken als een sjabloon DNA en dus is beperkt tot laat S en G2/M fasen van de celcyclus9,10. Non-homologe einde deelname aan (NHEJ) beschikt niet over deze beperkingen maar kleine verwijderingen kan veroorzaken wanneer DSBs11,12te herstellen.
DSB herstellen specifiek en de DDR in het algemeen zijn actieve gebieden van onderzoek. Ondanks het in gunstig gescheiden trajecten wordt georganiseerd, is er een grote hoeveelheid redundantie. Inderdaad, veel eiwitten (BRCA1 BRCA2 en de RPA complexe bijvoorbeeld) zijn betrokken bij meerdere trajecten13,14,15,16. De reparatie van een laesie door één traject, kan leiden tot een tussentijdse schade die moet worden hersteld door een ander traject14. De verwevenheid van deze trajecten, gecombineerd met hun complexe taak van het werven van de juiste eiwitten op de juiste plaats voor de nauwkeurige hoeveelheid tijd die nodig is, vereist een multi-tiered regelgevingsproces.
Een recent rapport benadrukt de fijne kneepjes van de DDR door aan te tonen dat reparatie complexvorming, resolutie en lokalisatie elk afzonderlijk verminderde17 kunnen. Het algemene doel van het volgende protocol is definitief het ontleden van het vermogen van de cellen te herstellen van DSB. Met behulp van immunofluorescentie microscopie, kan accumulatie van reparatie eiwitten op de sites van de schade worden gevisualiseerd op de representatieve tijdstippen na de inductie van DSBs.
Deze techniek heeft meerdere voordelen voor veelgebruikte benaderingen. Reparatie is vaak onderzocht op keer punten en niet in staat om het dynamische proces van vergadering en dissociatie van reparatie complexen te vertegenwoordigen. Observatie van het volledige scala van reparatie van de eerste activering naar de volledige resolutie zorgt ervoor dat een vertraging in de reparatie niet als volledige remming onrechte is. Omgekeerd, het verzekert dat de inductie van een reparatie-antwoord dat niet inactivering van genoemde reactie niet als de normale of de overmatige activatie onrechte is.
Vertraagde eiwit complexvorming en de mis lokalisatie van reparatie eiwitten, echter, kunnen niet worden ondubbelzinnig onderscheiden met deze aanpak. Om te bepalen of reparatie eiwitten mis gelokaliseerde versus vertraagd in hun lokalisatie, kan een “long-lasting” DSB worden ingevoerd via enzymatische splitsing van cellulaire DNA. De resulterende laesie is telkens die het product gerepareerd wordt, wat resulteert in een duidelijke grote nucleaire reparatie focus en het verwijderen van de wereldlijke beperking van aanwerving wegging. Dit kan worden bereikt door aanpassing van de bestaande aanpak met het gebruik van een zeldzame snijden endonuclease (b.v., SceI) voor het opwekken van een langdurige DSB. De levensduur van DSBs maakt de visualisatie van de ongrijpbare reparatie eiwitten door immunofluorescentie microscopie. De verbeterde overvloed kan ook de visualisatie verbeteren wanneer detectie wordt belemmerd door de beperking van de antilichaam-kwaliteit, een functie die nuttig zijn kan wanneer de mindere bestudeerde eiwitten zijn geïdentificeerd als die van invloed zijn op DNA-herstel.
Wij bieden met name expliciete instructies voor een gratis image verwerking en analyse software (bijvoorbeeldImageJ). Hiermee verwijdert u een grote financiële belemmering in beeldanalyse, openen de ondervraging van DNA-herstel van de schade aan een breder publiek.
Protocol
Representative Results
Discussion
De analyse van DNA schade reparatie in het algemeen en de reparatie van de double-stranded DNA-einden specifiek is een actief gebied van onderzoek, omdat de gevolgen ervan beslaan tumorvorming tot fundamentele biologie6,20. Dit manuscript details een aanpak die nauwkeurig de bijdrage van RAD51 en γ-H2AX eiwitten naar de resolutie van DSBs door HR. Verheugen, deze methode ontleedt kan worden gebruikt voor het verhelderen van de extra functies van reparatie eiwitt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Joel Sanneman en Dr. Philine Wangemann van de Confocal Microscopie kern, gefinancierd door de Kansas State University College of Veterinary Medicine, voor hun steun aan de inspanningen voor de ontwikkeling van deze techniek. pCBASceI was een geschenk van Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. U2OS DR-GFP cellen waren een soort geschenk van Maria Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D’Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D’Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases–from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
