Протокол для индукции в vitro эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT), которая является полезной для расследования сотовой сигнальных путей, участвующих в EndMT, описал. В этой экспериментальной модели EndMT вызванные лечение с TGF-β в эндотелиальных клетках MS-1.
Фенотипические пластичности эндотелиальных клеток лежит в основе развития сердечно-сосудистой системы, сердечно-сосудистые заболевания и различные условия, связанные с фиброзом орган. В этих условиях дифференцированной эндотелиальные клетки приобретают мезенхимы как фенотипы. Этот процесс называется эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT) и характеризуется Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров, и морфологических изменений. EndMT индуцируется несколько сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и паз и регулируется молекулярные механизмы аналогичны эпителия мезенхимальных перехода (EMT) важные для гаструляция, фиброз тканей, и метастазами рака. Понимание механизмов EndMT имеет важное значение для разработки диагностических и терапевтических подходов, ориентации EndMT. Надежные индукции EndMT в vitro полезным характеризовать общим подписи выражение гена, определять druggable молекулярных механизмов и экран для модуляторы EndMT. Здесь мы описываем в vitro метод для индукции EndMT. MS-1 мыши поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки проходят EndMT после увеличиваемой подвержения к TGF-β и показать upregulation мезенхимальных маркеров и морфологические изменения, а также индукции несколько воспалительных chemokines и цитокинов. Также включены методы для анализа микроРНК (miRNA) модуляции. Эти методы предоставляют платформу для изучения механизмов лежащих в основе EndMT и вклад адаптивной к EndMT.
Эндотелия мезенхимальных переход (EndMT) является процессом, в котором дифференцированной эндотелиальных клеток проходит целый ряд молекулярных изменений, что приводит к фибробластоподобных мезенхимальных клеток1. Первоначально EndMT был описан как преобразование эндотелиальных клеток во время разработки в сердце2,3. В начале развития сердца сердце трубка состоит из эндокарда внутренний и наружный миокарде. Эти два слоя разделены слоем внеклеточного матрикса, называется сердечной желе. Эмбриональные клетки эндокарда, которые приобретают эндотелиальных клеток маркеры, транзита в Мезенхимальные клетки, вторгнуться базовой сердца желе и способствуем формированию сердца подушки, создавая основу для Предсердно-желудочковые клапаны и перегородки и Полулунные клапаны. Кроме того было предложено EndMT быть источники pericytes и сосудистой гладкой мышечной клетки в других эмбриональной сосудистой системы, включая коронарных сосудов, брюшной аорты и легочной артерии4,5,6. Кроме того EndMT причастны физиологических ангиогенных прорастания7.
Накапливая доказательства предположил, что EndMT также участвует в нескольких сердечно-сосудистых заболеваний и других болезней1,8. EndMT связанного условия включают сосудистой кальцификации, атеросклероз, легочной артериальной гипертензии, кавернозных мальформация, орган фиброз, вен трансплантата Ремоделирование, аллотрансплантатом дисфункции в трансплантации почки и рак8, 9,10,11,12,13,14,,1516,17, 18. недавнем докладе говорится, что несколько молекулярных маркеров EndMT может быть инструментом для диагностики и прогноза предсказания дисфункции почек трансплантата в почечной трансплантации17. Модуляции клеточных сигнальных путей, связанных с EndMT было показано для улучшения несколько условий болезни, включая фиброз сердца и вен трансплантата Ремоделирование в животных моделей8,15. Таким образом понимание механизмов базовой EndMT важно развивать диагностические и терапевтические стратегии, ориентированные EndMT.
EndMT характеризуется потерей ячеек развязок, увеличение миграционным потенциалом, Даунрегуляция эндотелиальной конкретных генов как ве Кадгерины и upregulation мезенхимальных генов, включая актина α-гладких мышц (α-SMA). Кроме того EndMT и эпителия мезенхимальных перехода (EMT), аналогичный процесс, который преобразует эпителиальных клеток мезенхимальных клеток, связаны с измененной производства различных компонентов внеклеточного матрикса, которые могут внести вклад в развитие 8,фиброз тканей19.
Недавно несколько исследований в пробирке EndMT раскрыты подробности молекулярных механизмов EndMT15,20. EndMT индуцируется различных сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и надрезать1. Среди них TGF-β играет ключевую роль в индукции EMT и EndMT. В EndMT продолжительное воздействие TGF-β результаты в EndMT в различных эндотелиальных клеток, в то время как короткие выдержки, как представляется, недостаточно21. Здесь мы описали простой протокол для индукции EndMT, в которых Свен 1 миля (МС-1) поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши пройти EndMT в vitro после увеличиваемой подвержения к TGF-β20. В этой модели можно выполнить несколько ниже по течению анализа расследовать отличительной черты EndMT, в том числе морфологические изменения, Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров и воспалительные гены, цитоскелета перестановки и сокращение гель коллагена.
МикроРНК (интерферирующим) являются ~ 22 nt малых регулирования РНК, которые направляют посттранскрипционного репрессии в отношении различных мРНК целей22,–23. Через признание целевой последовательности опосредованной семян адаптивной подавить сотни целевых генов и модулировать различных клеточных функций, таких как дифференцировки клеток, распространением и подвижности. Это также касается регулирования EMT и EndMT, и несколько интерферирующим были зарегистрированы как регуляторы EMT и EndMT24,25. EndMT модель, представленная в этом обзоре можно легко комбинируется с Мирна модуляции процедур для проверки роли интерферирующим в EndMT. Настоящий обзор обобщает наши экспериментальные процедуры расследования TGF-β-индуцированной EndMT в клетках MS-1 и также включает в себя сравнение условий EndMT индукции, TGF-β в других эндотелиальных клеток.
Сообщается, что активированные ран и TGF-β лечения для 24 h индуцированных EndMT в клетках МС-1, в то время как TGF-β только удалось побудить EndMT в этот короткий период21. Последовательно мы наблюдали, что TGF-β существенно индуцированных EndMT после длительного лечения (48-72 ч) в MS-1 клетки<s…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Zea Борок и Kohei Miyazono за предложения по подготовке рукописи. H.I.S. и M.H. поддерживаются Уэхара Мемориальный фонд исследовательских стипендий, и H.I.S. поддерживается Осаму Hayaishi Мемориал стипендии для обучения за рубежом. Эта работа была поддержана грант от фонда науки Такеда (А.С).
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |