עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.
גמישות פנוטיפית תאי אנדותל ביסוד פיתוח מערכת הלב וכלי דם, מחלות לב וכלי דם והתנאים שונים הקשורים עם פיברוזיס איברים. בתנאים אלה, תאי אנדותל הבדיל רוכשים פנוטיפים כמו mesenchymal. תהליך זה נקרא מעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), והוא מאופיין על-ידי downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, שינויים מורפולוגיים. EndMT הנגרמת על ידי מספר איתות המסלולים, לרבות הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β, ונ ט, חריץ, ומוסדרת על ידי המנגנונים המולקולריים דומים לאלה של אפיתל mesenchymal המעבר (החובשים) חשוב עבור gastrulation, פיברוזיס רקמות, ו גרורות סרטן. הבנת המנגנונים של EndMT חשוב לפתח גישות איבחוניות מיקוד EndMT. אינדוקציה חזקים של EndMT במבחנה זו שימושית לאפיין את חתימות ביטוי גנים משותפים, לזהות את המנגנונים המולקולריים druggable להבדק מאפננים של EndMT. כאן, אנו מתארים שיטה במבחנה עבור אינדוקציה של EndMT. תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר MS-1 עוברים EndMT לאחר חשיפה ממושכת TGF-β ולהראות קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, שינויים מורפולוגיים, כמו גם אינדוקציה של מספר נוגדנים דלקתיים וכן ציטוקינים. שיטות לניתוח של אפנון microRNA (miRNA) הינם כלולים גם. שיטות אלה מספקים פלטפורמה לחקור את המנגנונים שבבסיס EndMT ועל תרומתה של miRNAs כדי EndMT.
המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT) היא התהליך שבאמצעותו תא אנדותל הבדיל עובר מגוון שינויים מולקולריים, וכתוצאה מכך פיברובלסט דמוי תא mesenchymal1. EndMT תוארה בתחילה טרנספורמציה תא אנדותל במהלך הפיתוח של הלב2,3. בהתפתחות הלב המוקדמת, הצינור הלב מורכב endocardium הפנימי של שריר הלב החיצוני. שתי שכבות אלה מופרדים באמצעות שכבה של מטריצה חוץ-תאית, קרא את הג’לי הלב. התאים endocardial עובריים, אשר רוכשים תאי אנדותל סמנים, מעבר לתאי mesenchymal, לפלוש הריבה הלב הבסיסית, ולקדם היווצרות הכרים הלב, מתן הקרן עבור שסתומים atrioventricular ומחצה השסתומים semilunar. יתר על כן, EndMT הוצע להיות מקורות pericytes תאי השריר החלק בכלי הדם במערכות אחרות כלי דם עובריים כולל הדם הכליליים, העורק הראשי של עורק הריאה-4,–5,–6. בנוסף, הייתה שם EndMT ב האנגיוגנזה פיזיולוגיים הלבלוב7.
לצבירת ראיות הציע כי EndMT מעורבת גם מספר מחלות לב וכלי דם, מחלות אחרות,1,8. תנאים הקשורים EndMT לכלול הסתיידות כלי הדם, טרשת עורקים, יתר לחץ דם עורקי ריאתי, מום חלול, איברים פיברוזיס, שיפוץ שתל הווריד, תפקוד להשתלת השתלת כליה וסרטן8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. לאחרונה דו ח תיאר כי מספר סמנים מולקולריים EndMT יכול להיות כלי חיזוי האבחנה והפרוגנוזה של חוסר תפקוד כליות שתל כליה השתלת17. אפנון של הקשורות EndMT הסלולר איתות המסלולים הוכחו דהוא מספר תנאים המחלה כולל הלב פיברוזיס, וריד שתל שיפוץ של בעל חיים מודלים8,15. לכן, הבנת המנגנונים EndMT הבסיסי הוא חשוב לפתח אסטרטגיות איבחוניות מיקוד EndMT.
EndMT מאופיין על ידי אובדן של צמתי תא-תא, הגדלת הפוטנציאל נודדות, downregulation של גנים ספציפיים אנדותל כגון VE-קדהרין ולאחר קולטנים upregulation של גנים mesenchymal כולל שריר α-חלק אקטין (α-SMA). בנוסף, EndMT ו- mesenchymal-אפיתל המעבר (אמבולנס), תהליך דומה הממירה לתאי האפיתל לתאי mesenchymal, הם קשורים שינו בייצור רכיבים שונים מטריצה חוץ-תאית, אשר עשוי לתרום להתפתחות של רקמת פיברוזיס8,19.
לאחרונה, מספר במבחנה מחקרים של EndMT יש מבואר הפרטים של המנגנונים המולקולריים של EndMT15,20. EndMT הנגרמת על ידי איתות המסלולים השונים כולל הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β, ונ ט, וחלק1. ביניהם, TGF-β ממלא תפקיד מרכזי אינדוקציה של החובשים והן EndMT. ב- EndMT, ממושך חשיפה תוצאות TGF-β EndMT בתאי האנדותל שונים, בזמן חשיפה קצרה שנראה אין די21. אנחנו כאן תיאר פרוטוקול פשוטה עבור אינדוקציה EndMT, איזה מייל סוון 1 (MS-1) תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר עוברים EndMT במבחנה לאחר חשיפה ממושכת ל TGF-β20. במודל זה, ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם מרובים כדי לחקור תכונות סימן ההיכר של EndMT, כולל שינויים מורפולוגיים, downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, גנים דלקתיים, cytoskeletal rearrangements, התכווצות ג’ל קולגן.
Rna (miRNAs) הם ~ 22 nt קטן RNAs רגולציה ישירה הדיכוי posttranscriptional של mRNA שונים מטרות22,23. דרך זיהוי המטרה בתיווך רצף זרע, miRNAs לדכא את מאות גנים היעד, לווסת פונקציות הסלולר מגוונים כגון תאית התמיינות, התפשטות, תנועתיות. זהו גם המקרה של רגולציה של החובשים, EndMT, דווח על מספר miRNAs כמבקרי סמביוזה24,החובשים, EndMT25. המודל EndMT שהוצגו בסקירה זו ניתן לשלב בקלות miRNA נהלים אפנון לבחון את התפקידים של miRNAs ב- EndMT. הסקירה הנוכחית מסכמת שלנו בצרות לחקור TGF-β-induced EndMT בתאים MS-1, כולל גם השוואה של תנאים האינדוקציה EndMT על ידי TGF-β בתאי האנדותל אחרים.
בעבר דווח כי הטיפול Ras ו- TGF-β מופעל במשך 24 שעות ביממה המושרה EndMT בתאים MS-1, בעוד TGF-β לבד לא הצליחה לגרום EndMT זו תקופה קצרה21. באופן עקבי, הבחנו כי TGF-β באופן משמעותי המושרה EndMT לאחר טיפול ארוך יותר (48-72 שעות) ב- MS-1 תאים20… EndMT נצפתה שוב ושוב לאחר טיפול ממושך עם TGF-β (2-6 ימים) בת…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Zea אחרי הכרזת העצמאות בהודו, Kohei Miyazono על הצעות הכנה של היד. H.I.S., מ. ה נתמכים על ידי אנדרטת Uehara קרן מחקר לאגודה, H.I.S. נתמכת את המלגה של ממוריאל Hayaishi וסאמא עבור מחקר בחו ל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן המדע טקדה (A.S.).
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |