Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino
Summary
Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.
Abstract
Trasplante de islotes pancreáticos para reducir la hiperglucemia es exitoso en roedores con diabetes inducida químicamente. El sitio más común de trasplante en el trasplante de islote experimental es la cápsula del riñón. Sin embargo, como se sabe menos acerca de la interacción de islotes pancreáticos con los componentes de la sangre, también tiene sentido utilizar el enfoque de la vena porta en el trasplante de islote experimental.
Este protocolo muestra una técnica de trasplante intraportal islotes en ratones desnudos NMRI. Streptozotocin (180 mg/kg) se inyecta por vía intraperitoneal para inducir hiperglucemia en ratones receptores. Se consideran como diabético a un nivel de glucosa en sangre no ayuno mayores que 20 mmol/L. Un día antes del trasplante, islotes pancreáticos de ratón son aislados de páncreas de donante por digestión de colagenasa; un mínimo de 350 islotes son utilizados por beneficiario diabético. Según el rendimiento de aislamiento de islotes pancreáticos, ratones de donantes de dos o más son utilizados por destinatario. Después de la cultura durante la noche a 37 ° C, islotes son administrados en el destinatario hígado vía la vena porta. Después de la cirugía, los ratones son protegidos en casas de Makrolon rojo y observados hasta despierto. Este protocolo mantiene control de la glucemia durante 120 días en ratones syngeneic y 15 días en ratones alogénicos.
Introduction
Trasplante de islotes pancreáticos es un enfoque prometedor para tratar tipo 1 diabetes mellitus1. El primer intento de transferencia de un fragmento de páncreas de oveja en un paciente diabético fue realizado por Watson Williams en 1893. Sin embargo, se logró un importante avance en el trasplante clínico de islotes pancreáticos con el protocolo de Edmonton, y después de eso, una serie de programas nacionales fueron desarrollados2. En el pasado, varios sitios, como la médula ósea, bolsa omental, intramuscular región, superficie de la mucosa gástrica, bazo y la cápsula renal, fueron explorados en modelos preclínicos, pero el sistema venoso portal se considera como uno de los sitio conveniente y eficaz para los programas clínicos3,4,5,6.
La administración exógena de insulina puede ser sustituida por infusión de islotes en la vena porta. Esto se considera un sitio preferido porque el suministro de oxígeno es comparable a la del páncreas nativo debido a la ubicación aguas abajo de la confluencia de la arteria porta y la vena. Además, hay una gran superficie, por lo que la estructura tridimensional de los islotes puede ser preservada y vascularización puede ser facilitado5. En un ratón diabético destinatario, 2.000 equivalentes del islote humano o porcino o ratón 350 islotes son suficientes para revertir el estado hiperglucémico7,8. Hiperinsulinémico niveles registraron durante 15 días en el modelo de receptor de ratón de islotes xenogeneicos y en el modelo de ratón a ratón alogénico y para más de 120 días del trasplante syngeneic de ratón a ratón.
Factores pertinentes a la eficacia del trasplante de islotes pancreáticos a través de la vena porta son anestesia adecuada, método de puntura y hemostasia9. La anestesia puede ser inducida por inhalación (5% isoflurano) o inyección (ketamina xilacina y pentobarbital), y a menudo se combinan las sustancias. Para el control de la profundidad y tiempo de anestesia, debe prestarse atención al estado del ratón, como el color de la mucosa, párpado, reflejo corneal, la frecuencia respiratoria y temperatura corporal. Es importante asegurarse de que el animal no está luchando y que sobrevive a la operación. La temperatura se puede mantener por aparatos de calefacción diferentes, tales como cojines de calefacción, focos de luz roja, etc. A la placa termal caliente se ha utilizado para mantener una temperatura de 25-30 ° C entre el ratón y la tabla de la operación, que previene la aparición de hipotermia. Las dosis de los anestésicos son importantes, ya que todos ellos son metabolizados por el hígado, y función hepática puede ser transitoriamente desordenada por la infusión de la suspensión del islote. El punto ideal de punción de la vena porta es la posición entre la primera y la segunda vena tributaria.
El número de islotes y el volumen de inyección previsto también influir en el resultado del trasplante, como un volumen excesivo puede aumentar la tensión de esquileo. Un volumen de 0.2 mL se considera apropiado para el trasplante de islotes en la vena porta. La herida pinchar (aguja de calibre 26) induce sangrado de la vena porta, que necesita ser detenido de manera oportuna y eficaz. Gasa estéril o un dedo se puede aplicar con una mínima presión en el sitio de la punción durante unos 6 min a detener el sangrado. Tomado junto, portal islote inyección es eficaz y ofrece regulación de niveles de glucosa en sangre en modelos de ratón diabético químicamente inducida.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio se explora la vía intraportal de trasplante de islotes pancreáticos. Este protocolo es muy eficaz en el alivio de estrés diabético y ofrece una profunda oportunidad de explorar estudios de trasplante de islotes pancreáticos. Este protocolo confirma que cerca de 350 islotes murinos son capaces de revertir el estado hiperglucémico. Por otra parte, ninguno de los ratones murió durante el procedimiento y control de la glucemia fue alcanzado en todos los destinatarios. Niveles de glucosa en sangre y el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer Gundula Hertl por su apoyo.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
