マウス モデルにおける膵島の門脈内移植
Summary
膵島移植で 1 型糖尿病な場合を達成するために道はあります。糖尿病マウスの通常のブドウ糖のレベルを維持するために門脈内のルートを通じて移植技術について説明します。
Abstract
高血糖を抑える膵島移植は化学的に誘発性糖尿病を持つ齧歯類で非常に成功しました。実験的膵島移植における最も一般的な移植サイトは腎被膜です。ただし、以下は膵島の血液成分との相互作用について知られている、また理にかなって実験的膵島移植における門脈アプローチを利用します。
このプロトコルは、当所ヌードマウスにおける門脈内の膵島移植技術を示しています。ストレプトゾトシン (180 mg/kg) を受信者のマウスにおける高血糖を誘発する腹腔内注入します。20 ミリ モル/l. より大きい非空腹時血糖で糖尿病と見なされます1 日、移植前にマウスの膵島がドナーの膵臓由来のコラゲナーゼの消化力; によって350 小島の最小値は、糖尿病の受信者ごと利用されています。膵島分離歩留まりによりますが、2 つ以上のドナー マウス受信者ごとに活用されます。37 ° C で一晩培養後の小島は門脈を介して受信者の肝臓に管理されています。マウスの赤い「マクロロン」家で保護されているとまで観察の手術後、目を覚ましています。このプロトコルは、同系マウスの 120 日間と同種のマウスで 15 日間の血糖コントロールを維持します。
Introduction
膵島移植は、タイプ 1 の糖尿病1の治療に有望なアプローチです。糖尿病患者に羊膵フラグメントを転送する最初の試みは 1893 年にワトソン ウィリアムズが行った。臨床膵島移植で画期的だったエドモントンの議定書を達成し、その後、国家プログラムのシリーズが開発された2。過去には、前臨床モデルで骨髄、大網ポーチ、筋肉内地域、胃粘膜、脾臓、腎臓のカプセルなど、いくつかのサイトを検討したが、門脈系は適切かつ効果的なサイトの 1 つとして考慮されます。臨床プログラム3,4,5,6。
インスリンの外因性投与は、アイレット門脈内注入によって置き換えることができます。これは酸素の供給がポータル動脈と静脈の合流点の下流の場所のためのネイティブの膵臓に匹敵するので最寄りのサイトと見なされます。また、小島の立体構造を保持することがありますので、大きい表面積があるし、血管新生促進5ができます。糖尿病マウスの受信者、2,000 の人間や豚の膵島同等または 350 マウス島高血糖状態7、8を逆に適切です。外因のレベルは、同系マウスに移植に 120 日以上の異種膵島と同種のマウス-マウス モデルにおけるマウスの受信者モデルで 15 日間の報告されました。
門脈を介して膵島移植の有効性に関連する要因は、適切な麻酔穿刺・止血9法です。麻酔は、吸入 (5% イソフルラン) または (ケタミン、キシラジン、またはペントバルビ タール) の注入によって誘起することし、物質は頻繁に結合されます。深さの制御と麻酔の時間は、マウス、色の粘膜、目の蓋、角膜反射、呼吸数、体温などの状態に留意する必要があります。動物の苦労はないとそれが操作を存続を確保することが重要です。赤電球に、加熱パッドなどの異なる暖房機器で温度を維持できるなどの暖かいサーマル プレートはマウスとの発生を防止する操作テーブルの間 25-30 ° C の温度を維持するために使用されています低体温症。麻酔薬の投与量が重要で、それらのすべては、肝臓で代謝され、肝機能は一過性島ペンション.の注入によって乱れることがあります。門脈の理想的な穿刺のポイントは、最初と 2 番目の支流静脈間位置です。
小島と意図した注入量の数は、過剰なボリュームは、せん断応力を高める可能性がありますとも、移植の結果に影響を与えます。0.2 mL ボリュームは門脈に膵島移植に適したと見なされます。貫通傷 (26 g 針) は、タイムリーかつ効果的な方法で停止する必要がある門脈からの出血を誘発します。約 6 分、出血を止めるための穿刺のサイトで最低限の圧力で滅菌ガーゼまたは指を適用できます。撮影一緒に、ポータルの膵島の注入は効果的な化学物質誘発糖尿病マウスの血糖値を規制を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、膵島移植の門脈内のルートが検討されます。このプロトコルは糖尿病のストレスの緩和に非常に効率的な膵島移植の研究を探索する詳細な機会を提供しています。このプロトコルは、約 350 マウス島が高血糖状態を逆転させることができることを確認します。また、プロシージャの間に死んだマウスのどれも、血糖コントロールは、すべての受信者で達成されました。本体重量?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼女のサポートのためグンドラ ・ Hertl を認識したいと思います。
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
