Hier bieden we een demonstratie van het model van de cutane terugroepen zuig blister. Het model biedt een eenvoudige toegang tot het bestuderen van de menselijke in vivo adaptieve immuunresponsen, bijvoorbeeld in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.
Cutane antigeen-recall modellen toestaan voor studies van het menselijk geheugen reacties- in vivo. Wanneer gecombineerd met huid zuig blister (SB) inductie, biedt dit model de toegankelijkheid aan zeldzame bevolking van antigeen-specifieke T-cellen vertegenwoordiger van de reactie van de cellulaire geheugen, alsmede de cytokine communicatie in situ.
Dit verslag beschrijft de praktische procedure van een cutane recall, een SB-inductie en een oogst van antigeen-specifieke T-cellen. Om te illustreren de methode, de tuberculine huidtest wordt gebruikt voor antigene terugroepen in individuen die, voorafgaand aan deze studie, onderging een Bacillus Calmette-Guérin vaccinatie tegen een infectie met Mycobacterium tuberculosis. Ten slotte, voorbeelden van multiplex en stroom cytometrische analyses van SB specimens zijn voorzien, ter illustratie van hoge breuken van antigeen-specifieke multifunctionele CD4 + T-cellen beschikbaar door deze bemonsteringsmethode in vergelijking met cellen van het bloed werd geïsoleerd.
De hier beschreven methode is veilig en minimaal invasieve, biedt een unieke gelegenheid om te studeren zowel aangeboren en adaptieve immuunresponsen in vivo, en wellicht gunstig zijn voor een brede gemeenschap van onderzoekers die werken met cel-gemedieerde immuniteit en mens geheugen reacties, in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.
Een huid-SB is een kunstmatig opgewekte blister, die het mogelijk voor de oogst van cellen en vloeistof rechtstreeks uit de huid maakt. De techniek van het verhogen van SBs door vacuüm is een bekende tool op het gebied van Dermatologie gebruikt voor de studie van huid immunologie in gezondheid en ziekte1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. dit verslag toont aan hoe de SB-techniek gecombineerd met cutane antigene terugroepen (SB cutane recall methode) direct inzicht in adaptieve immuunresponsen in vivokan bieden.
Het principe achter de SB-inductie is eenvoudig: een licht vacuüm wordt toegepast op een klein gebied van de huid. De negatieve druk zal uiteindelijk dwingen de epidermis te scheiden van de dermis, het maken van een lokale blister gevuld met vloeistof en cellen1,2,9. De blister vloeistof kan worden geoogst door een fijne naald aspiratie en de inhoud kan worden gebruikt voor verdere studie in vitro.
In de afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de SB-methode voor de studie van in vivo immuunresponsen dan ziekten beperkt tot de huid10,11. De studie van de adaptieve immuniteit bij de mens wordt beperkt door het feit dat de cellen en cytokines van belang worden bemonsterd uit perifeer bloed omdat een invasieve bemonstering van de lymfeklier of gastro-intestinale mucosal weefsels onaanvaardbaar en onethisch zijn kan. Een voorbeeld is de studie langlevende menselijk geheugen T-cel-respons na vaccinatie12. De bemonstering van relevante T-cellen kan een grote uitdaging, omdat de betrokken bevolking van cellen die immuniteit bemiddelen in het lymfoïde weefsel woont in dergelijke proeven, en slechts een zeer beperkt aantal specifieke T-cellen in het perifere bloed circuleren.
De SB-techniek biedt een unieke gelegenheid om de studie van geheugen T-cellen en andere specifieke cel populaties. Naar aanleiding van de cutane inoculatie van antigeen, T-cellen specifiek voor het antigeen worden gerekruteerd uit hun lymfoïde hideaways voor de huid en kan gemakkelijk worden bemonsterd uit de SB. De methodologie en onderzoek toepassingen van dit model voor cutane recall werden beschreven door Akbar et al. in 20132. Een veel gebruikte antigeen op hun huid rappel is de verkrijgbare gezuiverde eiwit afgeleide (PPD) van mycobacteriën gebruikt voor het uitvoeren van een tuberculine huidtest (TST)13, waar de PPD wordt geïnjecteerd in de dermale laag van de huid. Bij personen met een bestaande immunologisch geheugen naar PPD [bijvoorbeeld, personen met een infectie van het Mycobacterium tuberculosis (Mtb) of een eerdere vaccinatie van Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], de antigeen-afzetting resulteert in een herinner me de reactie met migratie op de huid en een in vivo klonale uitbreiding van PPD-specifieke CD4 + T-cellen2,11,14,15. Dientengevolge, hoge breuken van PPD-specifieke multifunctionele CD4 + T-cellen zich ophopen in de huid klaar voor SB bemonstering. T-cellen die door deze methode verzameld hebben bewezen als robuust en zijn voldoende overvloedig te worden gekenmerkt door een aantal immunoassay en door een lange termijn in vitro cultuur15. Dus, de cutane recall-model en de SB-inductie blijken een waardevolle methode om te bestuderen in vivo T-cel reacties door ex vivo analyses en toegenomen kennis van deze aanpak in aanmerking voor onderzoekers met belangen in cellulaire immunologie en vaccintechnologie.
Dit rapport bevat de eerste stapsgewijze gids op hoe te zuiging blaren van de menselijke huid in PPD-geïnjecteerd huid veroorzaken. De cutane antigeen terugroepen model wordt aangetoond door middel van de TST bij BCG-gevaccineerde vrijwilligers. Ten slotte, de relevante ex vivo -analyse van de cellen en cytokines geïsoleerd door SB is blijkt. Phenotypical en functionele kenmerken van PPD-specifieke T-cellen verkregen door de SB-methode zijn grondig elders beschreven2,10,11,16,17, 18 , 19. dit verslag heeft tot doel de praktische en immunologische aspecten van de methodologie te vergemakkelijken van de toepassing van deze techniek door andere onderzoeksgroepen te bespreken.
Dit manuscript wordt een praktische procedure voor de studie van menselijk immuun geheugen reacties in vivo, cutane antigeen terugroepen en cel oogst via zuig blister inductie beschreven. TST werd gebruikt als een voorbeeld van intradermale antigeen afzetting en terugroepen van het BCG-vaccin. Tot slot was een voorbeeld van SB specimen karakterisering door flow cytometrische en multiplex cytokine analyse verstrekt, waaruit blijkt dat ongeveer een derde van de SB-cellen werden antigeen-specifieke polyfunctional T-cellen van het effector geheugen fenotype.
De kritische stappen van dit protocol zijn de intradermale injectietechniek, de zuig blister inductie en de punctie van de blister. In de eerste plaats vereist een juiste intradermale depositie opgeleid personeel. Een onjuiste afzetting kan leiden tot suboptimaal resultaten. PPD is over het algemeen een bekende en veilige cutane antigeen, maar de samenstelling kan variëren tussen de fabrikanten, vergelijkbaarheid13,20te beperken. Dit verslag bevat instructies voor een enkelvoudige intradermale afzetting van 2 TU, en eventueel twee parallelle depositie (2 x 2 TU), waarvoor aanvullende ethische goedkeuring kunnen. Echter, andere studies hebben gebruikt 10 TU, die de kans op een sterke huid reactie10,21 verhogen. Tijdens de SB inductie stap, zal kleine stapsgewijze verhogingen in de negatieve druk verminderen het risico op bloeding en blister breuk. De kans op besmetting met rode bloedcellen of leukocyten uit de bloedbaan zijn over het algemeen laag2. De aseptische punctie techniek voorkomt bacteriële besmetting en vermijden van contact tussen de naald punctie en de dermale blister vloer vermindert onzuiverheden van puin of ingezetene huidcellen. Sommige onderzoekers geven er echter de voorkeur om te oogsten SB vloeistof door een rollende druk uit te oefenen op de geperforeerde blister10. Mogelijk moet het doorprikken van de septa binnen de blister. De SB-techniek zelf is minimaal invasieve; samengevouwen SBs genezen zonder littekens en infecties zijn zeer zeldzaam. 2 echter een zekere mate van hypo-pigmentatie kan optreden en SB inductie moet waarschijnlijk worden vermeden bij mensen met een geschiedenis van colloïdale littekens.
Technische beperkingen omvatten lage cel Totaal opbrengsten en bijgevolg beperkte opties voor opslag op lange termijn. Relaties tussen het rendement van de leukocyten, klinische TST reacties, de blister grootte en erytrocyt besmetting geweest grondig beschreven elders2,10. In de BCG-recall experimenten hier gepresenteerd (Figuur 1) was de gemiddelde totale opbrengst van iedere blister 50.000, impliceert een kleinschalige experimentele opstelling met behulp van deze cellen, vooral als de SBC’s hebben de bestudeerde alleen15. Echter de specifieke T-cel-bevolking in een steekproef van SB meestal groter is dan wat wordt gevonden in PBMC monsters in beide vlakken relatieve en absolute cel. In het voorbeeld in Figuur 2gepresenteerd, waren het aantal triple-positieve PPD-specifieke T-cellen in een steekproef van 100.000 SB cellen meer dan 2 x groter is dan het aantal gevonden in 1 x 106 PBMCs van dezelfde donor (gegevens niet worden weergegeven). Een visuele scoring van de TST-reactie is de meest voorkomende klinische methode voor de beoordeling van M. tuberculosis geheugen. Van de nota, de onderliggende adaptieve immunologische reactie niet een hoogtepunt bereikt op hetzelfde moment als de klinische huid reactie2,21. Niet alle BCG-ingeënt of Mtb-blootgestelde personen zal ontwikkelen sterke TST reacties en strategieën voor classificatie, en een behandeling van monsters van TST non-responders, evenals een bestaande mycobacteriële overgevoeligheid in de studie bevolking, moeten worden overwogen vóór het initiëren van een recall-proces met behulp van deze methode. Ook, in zowel SB bemonsterings- en visuele scoren, er is een potentieel voor een theoretische vooroordeel bij personen met verminderde huid reacties als gevolg van mondiale of huid-gerelateerde verminderde immuniteit zoals gezien, bijvoorbeeld in de HIV-infectie en bepaalde leeftijdsgroepen2, 13,18,20. Bovendien, is de TST reactie met herhaalde testen in een immunologische systeembeveiliging bekend20,22. Echter blijven de SB cel fenotypen vrij constant wanneer TSTs herhaalde10 zijn. Deze observatie ondersteunt de rol van SB rappel in longitudinale studies van de cellulaire immuunresponsen.
Voor T-cel immunologen zorgt SB terughalen voor de oogst van hoge gehalten van antigeen-specifieke cellen. De timing van SB voor een steekproef uit een PPD-afzetting is echter kritiek als zowel de cellulaire samenstelling als de cytokine communicatie na verloop van tijd veranderen. In dit protocol, blaren waren geïnduceerde 7-day post challenge en de geïsoleerde cellen voornamelijk effector geheugen CD4 + T-cellen met inbegrip van hoge breuken van cellen met een co expressie van IL-2, IFN-gamma en TNF-α. Deze opmerkingen zijn in overeenstemming met eerdere studies beschrijven hoe T-cel activatie, proliferatie en differentiatie plaatsvindt in PPD-primer huid2,15,21. Kinetische SB studies in PPD-gesensibiliseerde personen suggereren dat de zeer vroege reactie van de huid aspecifieke is; echter al binnen de eerste dagen na de PPD-challenge, de reactie wordt gedomineerd door CD4 + T-cellen (beide centrale geheugen en effector geheugen fenotypen is beschreven), en na 3 dagen, de reactie wordt gedomineerd door hoge breuken van PPD-specifieke cytokine productie van CD4 + T-cellen2,8,10,15,21. Deze reactie van adaptieve cytokine nog waarneembaar voor meer dan 2 weken2,8,10,23. Dag 7 post-TST lijkt de meest optimale tijdstip voor het verzamelen van cytokine productie van geheugen CD4 + T-cellen2. Echter, andere tijdstippen, natuurlijk relevant kunnen zijn afhankelijk van het antigeen en de reactie van belang. Van de nota, in een studie, is de adaptieve PPD-reactie gemeld om een beetje eerder met een daling in de afscheiding van pro-inflammatoire cytokine reeds op 5 dagen post-TST10hoogtepunt te bereiken.
SB vloeistof bevat hoge niveaus van zowel pro-inflammatoire cytokines en andere eiwitten aangetoond dat ze representatief zijn voor de huid communicatie15,24. Kinetiek studies hebben aangetoond dat TNF-α en IFN-γ niveaus bij SB vloeistof piek na 3 dagen terwijl IL-2 niveaus piek na 7 dagen2,10, waarschijnlijk als gevolg van de dominantie van adaptieve reacties in dit latere stadium. Omdat SB cellen geactiveerd in vivo geweest, vertonen ze een hoge spontane cytokine release evenals een potentieel voor een specifieke uitgavekwesties op restimulation (Figuur 3 en 4).
Dit verslag concentreert zich op CD4 + T-cel-immuniteit. Zoals aangetoond in Figuur 2, de meerderheid van de geïsoleerde T-cellen waren inderdaad CD4 +, terwijl er bijna geen CD8 + T-cellen in de zuigkracht blister vloeistof. Dit komt overeen met andere studies van de SB PPD-recall rapportage lage proporties en een inferieur trekkende capaciteit van CD8 + T-cellen ten opzichte van CD4 + T cellen2,8,10,23. Een verdere karakterisering van de CD8 + bijdrage zou wenselijk zijn; Dit is echter buiten het bestek van dit verslag.
T-cellen worden beschouwd als essentieel voor de immuun controle van Mtb; het is echter moeilijk vast te stellen een betrouwbare correlaat van bescherming tot uiting in de adaptieve immuunrespons van het bloed25,26. Deze wegversperring belemmert ernstig de ontwikkeling van nieuwe TB vaccins, zoals op dit moment er geen alternatief voor grote en zeer kostbaar werkzaamheid proeven27 is. TB-vaccin ontwikkelaars bepalen vaccin immunogeniciteit door kleine en tijdelijke veranderingen in de vaccin-specifieke T-cel populaties in de bloed28,29te bepalen. Het is echter twijfelachtig of de kleine fractie van antigeen-specifieke T-cellen in het bloed circulerende relevant is (dat wil zeggen, kan migreren naar de site van een infectie en de vertegenwoordiger van de beheersing van de communicatie van de T-cel-rijk Mtb) 27 , 30 , 31 .
Gebaseerd op eerdere studies en de hierin gepresenteerde gegevens, vertegenwoordigt de SB cutane terugroepen model een onbenut potentieel voor de studie van de vaccin-specifieke T-cellen. Niet alleen laat het model een terugroepen van een vaccin antwoord gegenereerd decennia geleden, het staat ook de evaluatie van het ware geheugen potentieel in een weefsel-specifieke context15,18,19,21. Roman, specifieke tests van de huid, waaronder antigenen ook samengesteld van kandidaat-subeenheid TB vaccins, suggereren nieuwe mogelijkheden voor vaccin evaluatie met behulp van dit model28,32. Bovendien transcriptomic analyses suggereren dat een cell – mediated immune reactie gegenereerd in PPD-uitgedaagd huid vergelijkbaar met het antwoord gevonden in de Mtb is-Long18besmet.
Terwijl huid punch biopsieën ook voor de oogst van een cel uit de huid verlenen en ruimtelijke informatie, vergeleken met SB de bemonstering, de methode is meer invasief en enzymatische of mechanische verwerking te bereiden eencellige schorsingen33vereist. Metingen van cytokines en cel markers zijn vergelijkbaar tussen de twee methoden2,10.
De zuiging blister methode is al toegepast in vele gebieden van medisch onderzoek naast Dermatologie, hetzij alleen of in combinatie met een systemische of lokale huid uitdaging. Voorbeelden zijn studies van sepsis, Epstein – Barr virus-geassocieerde proliferatieve ziekten, diabetische neuropathie, glucocorticoide inname effecten en menselijke proeven, testen van therapeutische antistoffen of modellen voor T-cel-gerichte therapieën10 ,34,35,,36,,37,38.
Van een therapeutisch oogpunt, de SB cutane recall methode biedt unieke voordelen bestuderen van de centrale T-cel-geheugen potentiële en -vanuit zowel een biologische en technisch oogpunt-de huid lijkt te bieden een relevante bemonstering compartiment2, 15,18,19,21. Vergeleken met traditionele, passieve bemonstering van circulerende PBMCs, in het bijzonder de SB cutane recall methode geschikt is voor de studie van T-cellen, die hebben bewezen de mogelijkheid om te migreren van de lymfeklier in reactie op hun relevante antigeen en vult u de lokale uitbreiding en differentiatie in een weefsel-specifieke in vivo kader15,18,19,21.
Kortom, het model aangetoond hier relevant voor onderzoekers op het gebied van menselijke adaptieve immuniteit en T-cel targeting agenten (dat wil zeggen, besmettelijke ziekte vaccintechnologie of kanker onderzoek) zou kunnen zijn. Het TST-model toegepast in dit protocol is, natuurlijk, van bijzonder belang op het gebied van TB vaccintechnologie. Het basisconcept van dit model is echter zeer toepassing in andere gebieden van onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen Mads Radmer Jensen danken voor zijn praktisch en academische advies; Lau Lindqvist en Kaare Svejstrup voor het verschaffen van technische deskundigheid; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov Signe T. Schmidt en Solveig W. Harpøth voor hun technische bijstand; het personeel op de polikliniek Gentofte TB voor hun opleiding in PPD administratie; en alle vrijwilligers voor hun deelname aan de studie. Dit project wordt gefinancierd door de Europese Commissie H2020 programma [subsidie nummer TBVAC2020 643381], en bedank we de partners van het consortium voor de vruchtbare discussies.
Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |