在这里, 我们提供了一个示范的吸入水泡皮肤召回模型。该模型允许一个简单的访问研究人体自适应免疫反应, 例如在疫苗开发的背景下。
皮肤抗原召回模型允许研究人的记忆反应在体内。该模型结合皮肤吸泡 (锑) 诱导, 为罕见的抗原特异性 T 细胞提供可访问性, 代表细胞记忆反应以及细胞因子微环境的原位。
本报告描述了皮肤召回的实际程序, 某人的诱导, 和一个抗原特定的 T 细胞的收获。为举例说明该方法, 结核菌素皮肤试验用于抗原召回的个人谁, 在本研究之前, 接受了 Guérin 芽孢杆菌疫苗接种的结核分枝杆菌感染.最后, 给出了细胞样品的多重性和流性分析的例子, 说明了这种取样方法与血液分离的细胞相比, 抗原特异性多功能 CD4+ T 细胞的高分。
这里描述的方法是安全和微创的, 提供了一个独特的机会, 以研究先天和自适应免疫反应在体内, 并可能有利于一个广泛的社区的研究人员细胞介导免疫和人类记忆反应, 在疫苗开发的背景下。
皮肤某人是人为诱发的水泡, 它允许从皮肤直接获得细胞和液体。采用真空法提高 SBs 的技术, 是皮肤病学领域的一个知名工具, 用于研究健康和疾病1、2、3、4、5、6,7,8. 本报告展示了如何将某一技术与皮肤抗原召回 (某人皮肤召回方法) 结合起来, 可以直接洞察体内的适应性免疫反应。
感应器背后的原理很简单: 轻真空被应用到皮肤的一个小区域。负压最终会迫使表皮与真皮分离, 造成局部水泡充满液体和细胞1,2,9。吸塑液可通过细针抽吸得到, 其含量可用于体外进一步研究。
近年来, 在人体免疫应答研究中, 除了受限于皮肤10、11的疾病外, 人们对该方法的兴趣越来越大。由于对淋巴结或胃肠粘膜组织的侵入性取样可能是不可接受和不道德的, 因此对人体自适应免疫的研究受到了来自外周血液取样的细胞和细胞因子的限制。一个例子是研究长寿命的人类记忆 T 细胞反应后接种12。在这种试验中, 相关 t 细胞的取样可能是一个巨大的挑战, 因为相关的细胞的免疫调节免疫力驻留在淋巴组织中, 只有非常有限数量的特定 T 细胞在外周血中循环。
某人的技术为研究记忆 T 细胞和其他特定细胞群体提供了一个独特的机会。在抗原的皮肤接种之后, 抗原特异的 T 细胞从他们的淋巴藏身之处被吸收到皮肤并且可以容易地被取样从某人。本文介绍了这种皮肤召回模型的方法和研究应用. 在 2013年2。一种常用的皮肤召回抗原是用于执行结核菌素皮肤试验 (尖沙咀)13的分枝杆菌的商用纯化蛋白衍生物 (ppd), 其中 PPD 被注入皮肤的真皮层。在对 PPD 有免疫记忆的个体中 (例如,结核分枝杆菌感染的个体或先前的卡介苗 Guérin (BCG) 疫苗), 抗原沉积导致召回反应与迁移到皮肤和体内克隆扩张的 PPD 特定的 CD4+ T 细胞2,11,14,15。因此, 高分数的 PPD 特异多功能 CD4+ T 细胞积累在皮肤准备为某人取样。这种方法收集的 T 细胞已被证明是健壮的, 足够丰富, 以一系列的免疫和长期的体外培养15为特征。因此, 皮肤召回模型和 SB 诱导可以证明是一种有价值的方法来研究在体内T 细胞反应的体外分析, 并增加知识, 这一方法可能有利于研究人员对细胞免疫学的兴趣和疫苗。
本报告提供第一个逐步指南, 如何诱导人皮肤吸入水泡在 PPD 注射皮肤。应用卡介苗接种疫苗的志愿者对皮肤抗原召回模型进行了验证。最后, 对人分离的细胞和细胞因子的相关体外分析进行了实证研究.用表型鉴定方法获得的 PPD 特异性 T 细胞的功能特征和作用特性在别处2、10、11、16、17、18,19. 本报告旨在讨论方法的实际和免疫学方面, 以减轻其他研究小组对这项技术的应用。
这篇手稿描述了一个实用程序, 研究人体免疫记忆反应在体内, 利用皮肤抗原召回和细胞收获的吸入水泡诱导。尖沙咀被用作皮抗原沉积和 BCG 疫苗召回的一个例子。最后, 通过流细胞和多重细胞因子分析, 给出了 sb 标本的一个例子, 表明约三个细胞是效应记忆表型的抗原特异多功能 T 细胞。
该协议的关键步骤包括皮下注射技术、吸塑诱导和吸塑穿刺。首先, 正确的皮下沉积需要训练有素的人员。错误的沉积可能导致不理想的结果。PPD 通常是一种众所周知的安全的皮肤抗原, 但其组成可能不同制造商之间, 限制可比性13,20。这份报告提供了一个单一的皮下沉积2涂, 可选的两个平行证言 (2 x 2 涂), 这可能需要额外的道德批准。然而, 其他研究使用了 10 TU, 增加了强烈皮肤反应的可能性10,21。在诱导阶段, 负压小逐步增加会降低出血和水泡破裂的风险。从血液中感染红细胞或白血病的几率一般低2。无菌穿刺技术可防止微生物污染, 避免穿刺针与真皮吸尘地板之间的接触, 减少碎片或居民皮肤细胞的杂质。然而, 一些研究人员更喜欢用轧制压力对穿刺水泡10来收割锑液。可能有必要刺穿水泡内的隔膜。某人的技术本身是微创的;折叠 SBs 愈合没有疤痕和感染是非常罕见的。2然而, 有一定程度的亚色素沉着可能发生, 并应避免诱导某人在具有胶体疤痕史的人。
技术限制包括低总电池产量, 因此长期储存的选择有限。白细胞产量, 临床尖沙咀反应, 水泡大小和红细胞污染之间的关系已被彻底描述在别处2,10。在这里提出的卡介苗召回实验 (图 1) 中, 每个水泡的平均总产量为 5万, 这意味着使用这些细胞进行小规模实验, 特别是如果 SBCs 单独研究15。然而, 在某一样品中, 特定的 T 细胞种群在相对和绝对细胞计数中的 PBMC 样本中的数量大多超过了所发现的。在图 2所示的示例中, 在 10万 SB 细胞样本中, 三阳性 PPD 特定 T 细胞的数量超过了同一个捐献者 1 x 106 PBMCs 中发现的数字的 2x (未显示数据)。尖沙咀反应的视觉评分是评价结核记忆的最常用的临床方法。值得注意的是, 潜在的适应性免疫反应并不与临床皮肤反应2,21的同时峰值。并非所有卡介苗接种或结核分枝杆菌暴露的个人都将制定强有力的尖沙咀反应和分类战略, 并处理来自尖沙咀非应答者的样本, 以及在研究人群中预先存在的结核杆菌敏感度,需要在使用此方法启动召回试验之前考虑。此外, 在某人的抽样和视觉评分, 有一个潜在的理论偏见, 皮肤反应减少, 由于全球或皮肤相关的免疫力受损, 如所见, 例如, 在艾滋病毒感染和某些年龄组2, 13,18,20。此外, 对尖沙咀反应的免疫促进与反复试验是众所周知的20,22。然而, 当 TSTs 重复10时, 某人的细胞表型保持不变。这一观察支持了某人在细胞免疫反应的纵向研究中所起的作用。
对于 T 细胞位免疫学家, 某人召回允许获得高分数的抗原特异细胞。然而, 当细胞成分和细胞因子微环境随着时间的推移而变化时, 某人从 PPD 沉积取样的时间是至关重要的。在本议定书中, 水泡被诱导7天后的挑战和孤立的细胞主要是 CD4+ 效应记忆 T 细胞, 包括高分数的细胞与干扰素-γ, TNF α, 和 IL-2 的共同表达。这些观察与以前的研究是一致的, 描述了 T 细胞的活化、增殖和分化发生在 PPD 引皮皮肤2,15,21。在 PPD 敏感的个体中, 某人的研究表明早期皮肤反应是不特异的;然而, 已经在 PPD 挑战后的第一天, 反应成为主导的 CD4+ T 细胞 (中央记忆和效应记忆表型被描述), 并且, 在3天以后, 反应由高分数控制PPD 特异的细胞因子产生 CD4+ T 细胞2,8,10,15,21。这种自适应细胞因子反应仍可检测2周2,8,10,23。7天后尖沙咀似乎是最理想的时间点收集细胞因子产生的记忆 CD4+ T 细胞2。然而, 其他时间点, 当然, 可能是相关的, 取决于抗原和反应的兴趣。值得注意的是, 在一项研究中, 自适应 PPD 反应已被报告为较早的峰值, 在5天后尖沙咀10的炎症细胞因子分泌减少。
液中含有高浓度的促炎性细胞因子和其他蛋白, 表现为皮肤微环境的15、24。动力学研究表明, 肿瘤坏死因子α和干扰素-γ水平在3天后, IL-2 水平峰值后7天2,10, 可能反映的优势, 自适应反应在这个后期阶段。由于某人细胞在体内被激活, 它们表现出高度自发的细胞因子释放, 以及在 restimulation 上的特定释放的可能性 (图 3和4)。
本报告的重点是 CD4+ T 细胞免疫。如图 2所示, 大多数孤立的 t 细胞确实是 CD4+ 的, 而吸入水泡液中几乎没有 CD8+ t 细胞。这符合其他人的 PPD 召回研究报告低比例和较低的迁徙能力的 CD8+ t 细胞相比, CD4+ t 细胞2,8,10,23。进一步描述 CD8+ 的贡献是可取的;但是, 这超出了本报告的范围。
T 细胞被认为是重要的免疫控制结核分枝杆菌;然而, 很难确定从血液25,26的适应性免疫反应中反映出的保护的可靠关联。这一路障严重阻碍了新的结核病疫苗的开发, 因为目前没有替代大型和非常昂贵的药效试验27。结核病疫苗开发商通过评估血液中28、29的疫苗特定 T 细胞种群的微小和瞬变变化来确定疫苗的免疫原性。然而, 在血液中发现的循环抗原特异性 T 细胞的小部分是否相关 (即能够迁移到感染部位并代表 T 细胞丰富的微环境控制) 是值得怀疑的。山地车)27,30,31.
根据先前的研究和本文所提供的数据, 某人皮肤召回模型代表了研究疫苗特异 T 细胞的未开发的潜力。这一模型不仅能够召回几十年前产生的疫苗反应, 而且还允许对特定于组织的上下文15、18、19、21中的真实记忆潜能进行评估。新的, 具体的皮肤测试, 其中包括抗原也由候选亚单位结核疫苗, 提出了新的机会, 疫苗评估使用这个模型28,32。此外, transcriptomic 分析表明, 在 PPD 挑战皮肤中产生的细胞介导的免疫应答类似于在结核菌感染的肺18中发现的反应。
虽然皮肤穿孔活检也允许从皮肤的细胞收获和提供空间信息, 与 SB 抽样相比, 这种方法更具侵入性, 需要酶或机械加工来制备单细胞悬浮液33。细胞因子和细胞标记的测量在两种方法2,10之间是可比较的。
吸塑法已经被应用于医学研究的许多领域, 除了皮肤病学, 单独或结合全身或局部皮肤挑战。例子包括脓毒症, eb 病毒相关的淋巴疾病, 糖尿病神经病, 糖皮质激素摄入的影响, 和人类试验测试治疗抗体或 T 细胞靶向治疗模型10 ,34,35,36,37,38。
从治疗的角度来看, 某人的皮肤召回方法为研究中心 T 细胞记忆潜能提供了独特的优势, 从生物学和技术的角度来看, 皮肤似乎提供了一个相关的取样室2, 15,18,19,21。特别是, 与传统的, 被动抽样的循环 PBMCs, 人皮肤召回方法, 以研究的 T 细胞已证明有能力从淋巴结迁移, 以响应其相关的抗原, 并完成当地在体内的组织特异的扩张和分化15,18,19,21。
总之, 这里所展示的模型可能与人类自适应免疫和 T 细胞靶向剂 (即传染病疫苗或癌症研究) 领域的研究人员相关。当然, 在本议定书中应用的尖沙咀模型在结核病疫苗领域具有特殊的相关性。但是, 该模型的基本概念在其他研究领域也有很高的应用价值。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Mads Radmer 詹森的实际和学术建议;刘 Lindqvist 和 Kaare Svejstrup 提供技术专长;海琳 Bæk Juel, 乔纳森 Filskov, Signe t. 施密特, Solveig W Harpøth 为他们的技术援助;Gentofte 结核病门诊诊所的工作人员在 PPD 管理方面的培训;和所有参加这项研究的志愿者。该项目由欧洲联盟委员会 H2020 计划 (赠款编号 TBVAC2020 643381) 提供资金, 我们要感谢联盟伙伴进行富有成果的讨论。
Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |