Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.
Kanser hücrelerinin rutin bir plastik yüzey üzerinde iki boyutta (2D) kültürlü. Bu teknik, ancak, gerçek ortamı bir tümör yoksun kitle içinde vivoiçin maruz. Solid tümör değil bir levha plastik için bağlı olarak büyümek, ama onun yerine bir üç boyutlu (3D) klonal hücre koleksiyonu gibi onların komşuları ile ve normal hücresel polarite bozulma gibi farklı mekansal özellikleri ile etkileşim alanı. Bu etkileşimler 3D kültürlü hücre içinde vivo tümörü daha alakalı olan morfolojik ve hücresel özellikleri elde etmek neden. Ayrıca, bir tümör kitle stromal ve bağışıklık hücreleri yanı sıra–dan diğer hücre tip hücre dışı matriks gibi diğer hücre türleri ile doğrudan temas halinde olduğunu. Kollajen ve fibronektin oluştururlar, yatırılır matris oluşur.
Bir girişim başucu için tezgah gelen Onkoloji araştırma bulguları ve çeviri artırmak için birçok grup kendi ilaç geliştirme stratejileri 3D modeli sistemlerinin kullanımı araştırmaya başladı. Bu sistemler bir tümör karmaşık ve türdeş olmayan ortam özetlemek girişimi çünkü daha fizyolojik ilgili olduğu düşünülür. Bu sistemler, ancak, oldukça karmaşık olabilir ve 96-şey biçimleri ve bazı şimdi bile 384 büyüme mükellef olmasına rağmen onlar büyük ölçekli büyüme ve tarama için birkaç seçenek sunar. Bu boşluğu yöntem tanımlamak burada ayrıntılı olarak kültür tümör pulcuklarının 1536-şey tabak içinde yüksek-den geçerek kapasite geliştirme yol açmıştır görülmektedir. Bu yöntemler bir uzlaşma son derece karmaşık matris tabanlı sistemler, ekran ve geleneksel 2D deneyleri için zor olan temsil etmektedir. Kanser hücre hatları farklı genetik mutasyonlar yataklık çeşitli başarıyla tarandı, Mitogen-Activated Protein Kinaz veya MAPK yolu hedefleme bileşiklerin küratörlüğünde bir kütüphane kullanarak bileşik etkinlik İnceleme. Küresel kültür yanıt-e doğru o zaman yanıt 2D olarak yetiştirilen hücrelerin karşılaştırılır ve fark faaliyetleri bildirdi. Bu yöntemler bir yüksek-den geçerek 3D ortamda bileşik etkinliğini test etmek için benzersiz bir protokol sağlar.
Son on yılda daha fazla çalışmalar tam olarak 2D hücrelerde plastik üzerinde büyüyerek recapitulated değil kavramları anlamak için 3D hücre kültür modellerinin kullanımı hayata geçirdik. Bu kavramlar değişiklikler hücrelerinin apikal ve bazal katmanları kayma yönünü nerede kayıp normal epitel hücre polarite1 , hem de hücre dışı matriks hayatta kalma ve hücre kader düzenlenmesinde rol örnekleridir. Onkoloji araştırma, özellikle, 3D modelleri temel biyoloji kanser hücreleri ve 2D ve 3D hücre kültür sistemleri3,4arasındaki farkları anlamak için kullandı. Daha gelişmiş hücre kültürü teknikleri ve onların daha fazla uyum çok iyi biçimleri için 3D ayarları’nda yeni ilaçlar için arama sağlamıştır. Karmaşık çok cell tipi küreler6,7için, koşullarda 2D, 3D modelleri tek hücre tipi alanlara farklı boyutlarda, katmanlı hücresel sistemleri5 karmaşıklık tümörler aralığının hücre aksine yetiştirilen 8. yeni bileşikler veya kuvvetli bu 3D modeli sistemlerinde hücre ölümüne neden destekte keşfi, bu nedenle, ilaç geliştirme kampanyalarının yüksek ilgi olduğunu. Bitiş noktaları bu deneyleri kez hücre çoğalması değişimler değerlendirmek için 2D kültürlerde geçekleştirilen aynıdır, ancak daha fizyolojik ilgili bir ortamda yürütülen zaman bağımlılık hedef gen veya yolu olma gerçek düzeyini ortaya çıkarabilir sorguya.
Yukarıda tanıtılan gibi çeşitli model sistemleri geliştirilmiştir 3D kültür sistemlerinde uyuşturucu yanıt çalışmaya, ama çoğunluk ya 96 veya 384-de microtiter plakaları kullanın ve sık sık kullanılan yüksek üretilen iş (HTS) eleme oluşum kolayca adapte değildir ilaç keşif tarama kampanyalar. Bu tür sistemleri damlacık teknolojileri, küresel kültürler, havaya yükselme ve kollajen, Matrigel veya Polietilen glikol (PEG)2 gibi doğal veya sentetik jelleri birleşmeyle kültürleri ikna etmek için manyetik parçacıklar hücrelerle zonklayan asılı kullanımını içerir . Burada, 3D küresel kültürler 1536-şey plaka biçiminde kurulan kanser hücre satırlarından üretmek için daha önce gelişmiş bir teknik detaylı yöntemleri mevcut. Bu protokol için yüksek tanımlı bir orta normalde yapisan hücre hatları9eki önleyen kullanılır. Bu sistem sınırlamaları vardır (yani, tam olarak karmaşık bir modeli sistem kanseri özetlemek olamaz), ama yine de, bu deneyleri bir yüksek-den geçerek tarama küçük moleküller büyük koleksiyonları ve uyuşturucu yanıtının Çapraz karşılaştırma etkinleştirin çeşitli hücre satırları ve bileşikleri karşı 2D ve 3D kültürler arasında.
Hücre hatları bu makaledeki yöntemlerden yolu, kanser, dysregulated son derece olan bir yol sinyal MAPK ilgili genlerin tüm liman mutasyonların göstermek için seçilen ve hangi birçok tedavi için kullanılabilir. Satırları da KRAS, Nöroblastom RAS veya NRAS, Harvey sıçan sarkomu virüs onkogen veya HRAS ve ilişkili kinaz hızla hızlandırılmış Fibrosarcomas da bilinir Kirsten sıçan sarkomu virüs oncogenic mutasyonların aktive var RAFs. Son edebiyat bu yolun farklı düğümlerin inhibitörleri 3D koşulları9,10altında yetiştirilen hücre satırları alt kümesinde benzersiz olarak daha etkili olduğunu göstermektedir. Bir çalışmada kanser hücrelerinin etkin RAS ile 3D kültürlü ne zaman, onlar MAPK inhibitörleri için artan bir hassasiyet gösterdi ve ayrıca, bu yaklaşım yolları tanımlayabilir ve geleneksel 2D cevapsız inhibitörleri hedef bulundu ayarı. Bu çalışmanın amacı bu hücre satırları kültür için kullanılan yöntemleri sunmaktır ve ayrıca, kültür sistemleri sadece 3D kullanırken gözlenen bu inhibitörleri yanıtlarını diferansiyel göstermek için hücre.
Burada sunulan yöntemleri 1536-şey tabak büyük ölçekli bileşik izlemek için tümör pulcuklarının üretmek nasıl ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu yöntemler başlangıçta nerede tümör pulcuklarının düşük işlem hacmi deneyleri genetik bağımlılıkları ve bileşik duyarlılık13, hakkında soru sormak için 6-şey ve 96-iyi tabak içinde yetiştirilen Ulusal Kanser Enstitüsü’nde işten adapte 14 , 1…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Marc Ferrer Ulusal Merkezi translasyonel Bilimler ilerleyen, Ulusal Sağlık Enstitüleri için onun destek ve rehberlik bu deneyleri ilk geliştirme için kabul etmek istiyorum. Buna ek olarak, Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling ve Vesselina Cooke onların bilimsel girdi ve ekip üyeleri proje olarak tartışma için teşekkür etmek istiyorum.
Reagents | |||
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
Consumables | |||
Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
Equipment | |||
Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
Spinning Incubator | LiCONiC | ||
Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |