عبر مجموعة واسعة من مؤشرات المرض، يجري النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا المخدرات المتقدمة وتنفذ في اكتشاف البرامج. النظام النموذجي الجديد الموصوفة هنا يوضح الورم ثلاثي الأبعاد كيف يمكن مثقف الماغنيسيوم وفرزهم في نظام القائم على لوحة الفائق 1536-جيدا للبحث عن أدوية جديدة لعلاج الأورام.
وقد تم مثقف الخلايا السرطانية بشكل روتيني في بعدين (2D) على سطح بلاستيك. هذا الأسلوب، ومع ذلك، تفتقر إلى البيئة الحقيقية ورم يتعرض فيفو فيكتلة. الأورام الصلبة تنمو ليس كورقة تعلق على البلاستيك، ولكن بدلاً من ذلك كمجموعة من الخلايا الاستنساخ في ثلاثية الأبعاد (3D) مساحة التفاعل مع جيرانهم، ومع الخصائص المكانية متميزة مثل اضطراب الاستقطاب الخلوي العادي. هذه التفاعلات تسبب الخلايا المستزرعة 3D اكتساب الخصائص المورفولوجية والخلوية التي أكثر صلة بأورام في فيفو . بالإضافة إلى ذلك، وجود ورم الشامل في الاتصال المباشر مع سائر أنواع الخلايا مثل الخلايا اللحمية ومحصنة، فضلا عن المصفوفة خارج الخلية من جميع أنواع الخلايا الأخرى. مصفوفة أودعت تتألف من الجزيئات الكبيرة مثل الكولاجين وفيبرونيكتين.
في محاولة لزيادة ترجمة نتائج البحوث في علم الأورام من مقاعد البدلاء إلى جانب السرير، بدأت العديد من المجموعات للتحقيق في استخدام نظم النموذج الثلاثي الأبعاد في استراتيجياتها الإنمائية الخاصة بالمخدرات. ويعتقد أن أكثر فسيولوجيا ذات الصلة نظراً لأنها محاولة لتلخيص البيئة المعقدة وغير متجانسة من ورم في هذه النظم. هذه الأنظمة، ومع ذلك، يمكن أن تكون معقدة جداً، وعلى الرغم من أن قابلة للنمو في تنسيقات 96-جيدا، وبعضها الآن حتى في 384، أنها توفر خيارات قليلة للنمو على نطاق واسع والفرز. ولاحظ هذه الفجوة قد أدى إلى تطوير الأساليب الموصوفة هنا بالتفصيل للثقافة الورم الماغنيسيوم في قدرة الإنتاجية العالية في لوحات 1536-جيدا. هذه الطرق تمثل حلاً وسطا للأنظمة المستندة إلى مصفوفة معقدة للغاية، من الصعب على الشاشة، وفحوصات 2D التقليدية. مجموعة متنوعة من خطوط خلايا السرطان إيواء الطفرات الوراثية مختلفة يتم فحصهم بنجاح، دراسة فعالية مركب باستخدام مكتبة المنسق من مركبات استهداف ميتوجيناكتيفاتيد البروتين كيناز أو MAPK المسار. ثم تتم مقارنة الردود ثقافة كروي لاستجابة الخلايا التي نمت في 2D، ويتم الإبلاغ عن الأنشطة التفاضلية. هذه الأساليب تقديم بروتوكول فريدة لاختبار نشاط المجمع في إعداد 3D الفائق.
في العقد الماضي، نفذت دراسات أكثر وأكثر استخدام نماذج الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لفهم المفاهيم التي لا يرد موجز لها تماما بزراعة الخلايا في 2D على البلاستيك. وتشمل أمثلة لهذه المفاهيم المصطنعة في الخلايا الظهارية العادية قطبية1 حيث يتم فقدان التوجه المكاني لطبقات قمي والقاعدية للخلايا، فضلا عن دور المصفوفة خارج الخلية في تنظيم بقاء ومصير الخلية. أبحاث علم الأورام، على وجه الخصوص، قد تستخدم نماذج ثلاثية الأبعاد لفهم البيولوجيا الأساسية للخلايا السرطانية والفروق في 2D و 3D خلية ثقافة النظم3،4. وقد مكن تطوير تقنيات استزراع خلية أكثر تطورا وعلى تكييف إضافية إلى صيغ متعددة جيدا البحث عن عقاقير جديدة في إعدادات ثلاثية الأبعاد. وعلى النقيض من الخلايا التي نمت في ظروف 2D، 3D نماذج من مجموعة الأورام في التعقيد من الطبقات الخلوية نظم5 مجالات نوع واحد من الخلايا ذات أحجام مختلفة، إلى مجالات متعددة سيل من نوع معقد6،7، 8-اكتشاف مركبات جديدة أو البيولوجي التي أظهرت تسبب موت الخلايا في هذه النظم نموذج ثلاثي الأبعاد، بالتالي، ارتفاع الفوائد في حملات التنمية المخدرات. نقاط النهاية لهذه الاختبارات غالباً ما تكون مطابقة لما تم تنفيذه في 2D الثقافات لتقييم التغييرات في تكاثر الخلايا، ولكن عندما تجري في أجواء أكثر فسيولوجيا ذات صلة، أنها قد تكشف عن المستوى الحقيقي لتبعية الجينات المستهدفة أو يجري المسار استجوب.
كما عرضت أعلاه، مجموعة متنوعة من نظم نموذجية قد وضعت لدراسة الردود المخدرات في نظم الاستزراع 3D، ولكن الأغلبية تستخدم أما لوحات microtiter 96 أو 384-جيدا وليست قابلة للتكيف بسهولة إلى صيغ الفرز (HTS) الفائق غالباً ما تستخدم في حملات الفحص اكتشاف المخدرات. تشمل هذه النظم استخدام معلقة التكنولوجيات الحبرية، الثقافات كروي، النبض الخلايا مع جزيئات مغناطيسية للحث على الارتفاع، والثقافات التي تتضمن المواد الهلامية الطبيعية أو الاصطناعية مثل الكولاجين أو ماتريجيل أو البولي إثيلين غليكول (شماعة)2 . نقدم هنا، مفصلاً أساليب تقنية المتقدمة سابقا لإنتاج الثقافات كروي ثلاثي الأبعاد من خطوط خلايا السرطان المنشأة في شكل لوحة 1536-جيدا. في هذا البروتوكول، تستخدم وسيلة محددة بدرجة عالية مما يمنع إلحاق خلية عادة ملتصقة خطوط9. هذا النظام قد القيود (أيأنها لا يمكن أن الخص تماما نظام طراز معقدة للسرطان)، ولكن على الرغم من ذلك، تمكن هذه الاختبارات فرز الفائق لمجموعات كبيرة من الجزيئات الصغيرة وإجراء مقارنات عبر فتحه لاستجابة المخدرات بين الثقافات 2D و 3D ضد مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والمركبات.
خطوط الخلايا المحددة لإظهار الأساليب الموجودة في هذه المقالة كل ميناء الطفرات في الجينات المتصلة ب MAPK إشارات الطريق، طريق الذي هو الغاية dysregulated في السرطان، وتتوفر فيه العديد من العلاجات. العديد من الخطوط بتفعيل النمطان الطفرات في فيروس “ساركومه الفئران كيرستن” يشار إليه أيضا كراس ورأس نيوروبلاستوما أو تجاوزها والسرطاني الفيروس “هارفي الفئران ساركومه” أو HRAS ومؤنزم المرتبطة “فيبروساركوماس التعجيل بسرعة”، المعروف أيضا رافس. الأدب الأخيرة تشير إلى أن مثبطات الفروع المختلفة لهذا المسار فريد أكثر نجاعة في مجموعة فرعية من خطوط الخلايا عندما نمت تحت ظروف 3D9،10. وجدت إحدى الدراسات أن عندما كانت استزراع الخلايا السرطانية مع RAS نشطة في 3D، أنها برهنت على الوعي المتزايد بمثبطات MAPK، وعلاوة على ذلك، أن هذا النهج يمكن أن تحدد مسارات واستهدفت الموانع التي قد تكون أخطأت في 2D التقليدية الإعداد. والهدف من هذه الدراسة تقديم الأساليب المستخدمة لثقافة هذه خطوط الخلايا، وعلاوة على ذلك، تثبت التفاضلية الردود على هذه الموانع التي يمكن ملاحظتها فقط عند استخدام 3D الخلية نظم الثقافة.
الأساليب المقدمة هنا إظهار بروتوكول مفصلة حول كيفية إنتاج الماغنيسيوم ورم في لوحات 1536-جيدا لعروض مجمع على نطاق واسع. هذه الأساليب كانت في البداية مقتبسة من العمل في المعهد الوطني للسرطان حيث كانت تزرع الماغنيسيوم ورم في فحوصات الإنتاجية المنخفضة في لوحات 6-جيدا وكذلك 96 طرح أسئلة حول تبعيا…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب تود أن تقر مارك فيرير في المركز الوطني للنهوض بالعلوم متعدية الجنسيات، والمعاهد الوطنية للصحة للدعم والتوجيه بشأن تطوير هذه الاختبارات الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر فريمان أليسون، مارييﻻ جاسكيليوف واكر مايكل، ويعقوب هالينج وفيسيلينا كوك للمدخلات العلمية والمناقشة كأعضاء فريق المشروع.
Reagents | |||
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
Consumables | |||
Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
Equipment | |||
Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
Spinning Incubator | LiCONiC | ||
Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |